Esperimenti di cromatografia su strato sottile

La cromatografia su strato sottile (TLC) è una tecnica di laboratorio molto usata per separare diverse sostanze biochimiche sulla base delle loro attrazioni relative alle fasi stazionarie e mobili. Usa un sottile strato di adsorbente come gel di silice, o amido o gesso su un substrato piatto e inerte. Più campioni sono separabili in contemporanea sullo stesso strato, il che la rende utile per applicazioni di screening come il test dei livelli dei farmaci e la purezza dell’acqua. Rispetto alla cromatografia su carta, ha il vantaggio di test più veloci, separazioni migliori, migliore analisi quantitativa e la scelta tra diversi adsorbenti.

Potresti avere familiarità con la cromatografia, ma forse non sai che, in effetti, il nome “cromatografia” deriva da alcuni primi esperimenti sulla cromatografia su strato sottile. La parola cromatografia, infatti, deriva dal greco chroma, “color”, e graphein, “scrivere”. Era una tecnica per separare sostanze che avevano colori diversi. In generale, nella cromatografia non è necessario che le sostanze da separare siano composti colorati, poiché esistono molti altri modi per rilevarle o identificarle.

Fondamentalmente, una cromatografia è qualsiasi tecnica di laboratorio in cui separiamo diversi componenti chimici di una miscela dalla loro affinità con una fase stazionaria (di solito gel di silice su strato sottile) e una fase mobile (il solvente o miscela di solventi). Gli esperimenti iniziali di cromatografia su strato sottile hanno permesso di separare i pigmenti (come il clorofillo) degli estratti vegetali, che si muovono a velocità diverse attraverso la fase stazionaria, divenendo visualizzabili.

Due esempi di cromatogramma su strato sottile di un estratto di piante contenenti pigmenti colorati, come ad esempio la clorofilla.

All’inizio, dunque, la cromatografia fu usata per la separazione di pigmenti vegetali (ad es. clorofilla, caroteni, xantofille). Poiché questi componenti hanno colori diversi (rispettivamente verde, arancione e giallo), hanno dato il nome alla tecnica. Nuovi tipi di cromatografia sviluppati negli anni ’30 e ’40 hanno reso la tecnica utile per molti processi di separazione. Gli sviluppi portasti da John Porter Martin e Richard L. Millington Synge negli anni ’40 e ’50 valsero loro il premio Nobel per la chimica del 1952.

I due hanno stabilito i principi e le tecniche di base della cromatografia di partizione e il loro lavoro ha incoraggiato il rapido sviluppo di diversi metodi cromatografici: cromatografia su carta, gascromatografia e quella che sarebbe diventata nota come cromatografia liquida. Da allora, la tecnologia è avanzata rapidamente. I ricercatori hanno scoperto che i principi fondamentali della cromatografia potevano essere applicati in molti modi diversi, risultando in diverse varietà di cromatografia.

Funzionamento della cromatografia su strato sottile

La cromatografia può essere molto complessa, ma la tecnica più semplice, più importante e più antica è la cosiddetta “cromatografia su strato sottile” (o TLC). Essa usa una fase stazionaria (molto spesso gel di silice) che si deposita su un supporto di vetro o alluminio. Possiamo quindi individuare miscele di composti sulla stessa linea. In pratica, “eluiamo” la miscela con un solvente organico e i diversi composti si sposteranno verso l’alto a velocità diverse, consentendo la separazione dei diversi componenti.

Le pochissime differenze fra la cromatografia su strato sottile e la cromatografia su carta.

L’eluizione (o eluzione) è un processo chimico volto a riportare in soluzione una sostanza trattenuta da una sostanza adsorbente lavandola con un solvente. In cromatografia l’eluizione è la separazione di due o più sostanze adsorbite per lavaggio con un opportuno solvente. Nella cromatografia su strato sottile, l’eluente trascina con sé i componenti (coloranti/inchiostri) della soluzione separandoli dall’altro componente della miscela in un tempo chiamato “tempo di eluizione del soluto”.

La cromatografia su strato sottile (TLC) è, in pratica, una tecnica economica, rapida e semplice per separare i componenti di una miscela. Una piastra per cromatografia TLC è una piastra di alluminio rivestita da uno “strato sottile” di una fase stazionaria, che di solito è (> 95% delle volte nella sintesi organica) gel di silice. La fase stazionaria, il gel di silice, contiene legami Si – O – H che si legano ai diversi composti delle miscele da separare in modo variabile a seconda della polarità dei composti stessi.

A questo punto, si eluisce la piastra. Praticamente la metti verticalmente in una camera chiusa che contiene una quantità appropriata di una miscela di solvente. Il solvente scorre lentamente lungo la piastra attraverso un’azione capillare. A seconda della natura del solvente usato (più polare o meno polare), alcuni composti si muoveranno verso l’alto più velocemente di altri. In generale, i composti più polari “scaleranno” più lentamente attraverso la piastra e quelli meno polari voleranno verso l’alto.

Separazione di due componenti principali di una miscela (macchia rosa e macchia rossa).

Quindi devi solo controllare quanti e dove sono presenti in ogni punto della piastra. Ogni punto corrisponde a un diverso composto chimico sulla miscela. Di solito avrai bisogno di una lampada UV (ultravioletta) per visualizzare i diversi punti – come quella che puoi procurarti facilmente online, ad esempio qui – ma se i composti sono fortemente colorati puoi facilmente vedere i diversi componenti della miscela. Ma ecco una guida dettagliata all’esecuzione di una cromatografia su strato sottile.

Occorrente per la cromatografia su strato sottile

Per realizzare questa esperienza avrai bisogno dei seguenti materiali:

  • Campioni da analizzare (ad es. inchiostri di pennarelli a base d’acqua)
  • Piastre cromatografiche per cromatografia su strato sottile fatte in casa (ad es. ricoperte di gesso o amido di mais) oppure acquistate online
  • Solvente/i (scelto a seconda del campione da analizzare, vedi più avanti; per partire puoi optare per uno dei seguenti, e magari poi ripetere l’esperimento con tutti gli altri: acqua, detergente per vetri non colorato, acetone, trementina, etanolo + miscela di acqua)
  • Barattolo di vetro grande (in grado di contenere una piastra verticalmente)

Le camere usate per la cromatografia su strato sottile. Un becher o un barattolo andrà altrettanto bene per mettervi dentro la piastra TLC.

La cromatografia su strato sottile è simile alla cromatografia su carta – illustrata nel nostro articolo Come effettuare la cromatografia su carta, che trovate qui – ma usa, al posto della carta, la polvere fine di alcuni prodotti chimici come fase stazionaria. Abbiamo quindi realizzato da soli le nostre piastre per cromatografia su strato sottile utilizzando dei vetrini portaoggetto per microscopia. Questo pezzo di vetro piatto è l’ideale per una piccola piastra che funzionerà bene per un semplice esperimento a casa.

È inoltre possibile confrontare diverse fasi stazionarie e testarle con sostanze diverse e solventi diversi, il che rende di per sé possibile un grande progetto scientifico di cromatografia. La plastica non deve essere utilizzata come supporto perché alcuni solventi potrebbero distruggerla. Come polvere per la fase stazionaria abbiamo usato amido o gesso. Potresti anche provare talco, gesso, possibilmente alcune vernici a base d’acqua o persino gel di silice (che però richiede una preparazione speciale difficile).

Quindi, se stai cercando piastre di gel di silice, dovrai acquistarle (puoi trovarle ad esempio in vendita qui). Per preparare le piastre per la cromatografia su strato sottile avrai assolutamente bisogno di 3 semplici cose:

  • Base della piastra (un vetrino da microscopio o un piccolo pezzo di vetro quadrato).
  • Fase stazionaria – amido di patate o amido di mais (detto anche “maizena”) o gesso o altro materiale suggerito.
  • Acqua.
  • Potresti anche aver bisogno di mortaio e pestello.

Ciò di cui hai bisogno per preparare le tue piastre TLC.

Metti la tua fase stazionaria (nel nostro esempio abbiamo usato l’amido di mais, o “maizena”, che puoi trovare ad es. qui) in una ciotola e aggiungi approssimativamente la stessa quantità di acqua. Un cucchiaio di amido richiede un cucchiaio di acqua. Mescola fino ad ottenere una sospensione uniforme. Versa con molta attenzione una piccola quantità di sospensione sulla piastra. Assicurati di non tenere la piastra ai lati, poiché ciò causerà la fuoriuscita della sospensione sul bordo della piastra non appena toccherà le dita. Avrai bisogno di un po’ di pratica.

A questo punto inclina la piastra con attenzione da un lato all’altro fino a quando la sospensione copre tutta la piastra come uno strato liquido sottile. Hai quasi finito. Metti la piastra in un luogo sicuro su una superficie orizzontale per farla asciugare. L’asciugatura di solito dura 24 ore. Dopo l’essiccazione, la superficie della fase stazionaria può presentare alcune piccole crepe. Ciò, comunque, non dovrebbe influire troppo sui risultati del tuo progetto scientifico di cromatografia.

Preparazione di una piastra TLC usando l’amido di mais.

Se lavori con il gesso, fallo cadere nel mortaio. Macinalo fino ad ottenere una polvere uniforme molto fine. La macinatura richiederà del tempo. È meglio fare questo passo bene o potresti riempire le tue piastre di pezzi di gesso che non sembrano belli e che influenzeranno i tuoi esperimenti. Quando si ottiene una polvere di gesso fine, la procedura è generalmente la stessa seguita per le piastre di amido.

Come eseguire la cromatografia su strato sottile

Ecco invece la procedura da seguire per effettuare la cromatografia:

  1. Taglia la tua piastra (opzionale)

Se necessario, devi prima tagliare un pezzo di piastra per TLC della dimensione appropriata. Qual è la dimensione appropriata? Dipende dallo scopo del TLC e da quanti punti è necessario separare. Se vuoi solo dare un’occhiata a quanti composti hai in una miscela, basta un punto. Le piastre TLC sono generalmente realizzate in alluminio rivestito dalla fase stazionaria e possono essere tagliate con le forbici. A volte, il materiale di supporto è il vetro e avrai bisogno di una taglierina per fare il lavoro.

Tipica piastra TLC e linea di spotting inferiore con i campioni da esaminare.

Di solito, una piastra cromatografica a strato sottile ha un’altezza di circa 5-7 cm e una linea viene disegnata a circa 0,5–1,0 cm dal fondo. Questa è la linea in cui individuerai le tue miscele da separare. È importante individuare le miscele al di sopra del livello di solvente nella camera di eluizione! Inoltre, lascia una certa separazione tra ciascun punto sulla linea di spotting inferiore (in modo che non si mescolino tra loro!) e lasci una separazione simile (di circa 0,5 cm) da ciascun bordo della piastra TLC.

  1. Colloca i campioni sulla piastra

Ora è tempo di preparare i campioni delle miscele da separare. Per semplicità, iniziamo con un solo punto, in cui metteremo una soluzione di una miscela di diversi composti. Per prima cosa dobbiamo preparare una soluzione della nostra miscela. La consueta concentrazione media di queste soluzioni è di alcuni milligrammi di miscela / composto in circa 0,5-1 ml di solvente. Quei pochi milligrammi sono totalmente approssimativi. Basta aggiungere una spatola o una punta di pipetta Pasteur e scioglierla in un po’ di solvente!

Una volta preparate le soluzioni, dobbiamo posizionare i campioni sulla linea di fondo della piastra TLC. È il È necessario, allo scopo, utilizzare un tubo capillare. Prendi una soluzione della miscela da esaminare con il tubo capillare e premila leggermente nel punto contrassegnato corrispondente intorno a 0,5–1 cm sopra la parte inferiore del TLC (usa SEMPRE una matita per segnare i punti in una piastra TLC! L’inchiostro di una penna, infatti, eluirà con solventi organici, la grafite non lo farà!).

Colloca le miscele TLC sul segno corrispondente nella linea di spotting sopra la parte inferiore della piastra. Quindi eluisci la piastra e vedi quanti composti ci sono nella tua miscela e quanto sono polari, semplicemente controllando i diversi punti.

Cerca di collocare le miscele nel modo più compatto possibile. Fai dei punti (spot) molto piccoli di campione. Macchie molto ampie faranno sovrapporre i diversi composti portando a separazioni non così piacevoli. Forse anche alcuni composti saranno nascosti poiché saranno fondamentalmente co-eluiti con altri punti enormi. In linea generale, i punti più diluiti e più piccoli sono la strada da percorrere. Di solito è sufficiente un leggero tocco del pennarello o stuzzicadenti per produrre un bel punto.

  1. Eluisci la piastra TLC

Ora è il momento di eluire la piastra. Per questo è necessaria una camera di eluizione. Ci sono opzioni commerciali specifiche a tale scopo. Un becher funziona bene. Anche un barattolo di marmellata pulito farà bene il lavoro! Ma in realtà puoi usare qualsiasi contenitore di vetro che puoi tappare. Non è necessario coprire la camera se si utilizza acqua come solvente, ma è importante se si tratta di solventi più volatili e maleodoranti come solventi per unghie, aceto, trementina, ecc.

Macchie della TLC (prima, in basso e dopo eluizione, in alto). A destra: TLC che eluisce nella camera del solvente.

Quindi è necessario riempirlo con circa 0,5 cm di altezza del sistema di solvente desiderato, o anche meno. La quantità di solvente dovrebbe essere piuttosto piccola, dovrebbe a malapena coprire il fondo. Dovrebbe esserci abbastanza solvente per toccare la base della piastra con fase stazionaria, ma non abbastanza per lavare le macchie di inchiostro del campione. Non esiste un miglior punto di partenza assoluto per la selezione di un sistema solvente. Tuttavia, una guida è la seguente:

  • Se stai lavorando con molecole organiche assolutamente apolari (nessun gruppo funzionale polare, solo C e H), come il naftalene, inizia con pentano o esano puri.
  • Se vuoi separare un composto con uno o due gruppi funzionali leggermente polari (etere, chetone, estere …), scegli una miscela esano / EtOAc 4: 1.
  • Se la tua molecola ha uno o due gruppi molto polari (alcool, ammina, ecc.), scegli 1: 1 esano / EtOAc.
  • Se la tua molecola è molto più polare (ad esempio uno zucchero, un amminoacido …), scambia esano con DCM e mantieni EtOAc come componente polare. Utilizza un rapporto 1: 1 se sei un principiante.
  • Se i tuoi composti sono così polari che non si spostano affatto dalla linea di base con DCM / EtOAc, scegli 9: 1 DCM / MeOH o anche 9: 1 EtOAc / MeOH.
  • Se nulla di tutto ciò funziona, stai osservando un composto estremamente polare e potresti prendere in considerazione l’uso della fase inversa (una fase stazionaria apolare, invece del gel di silice).

Alcuni comuni sistemi di solventi usati nella cromatografia su strato sottile.

Detto questo, è importante che il livello di solvente sia inferiore al punto iniziale in cui si individuano i campioni! Altrimenti, si diluiranno e non otterrai una separazione netta. Una volta che la camera è pronta, basta inserire la piastra TLC all’interno, in verticale, e attendere che il solvente salga per azione capillare. Occorre successivamente estrarre la piastra TLC quando il livello del solvente è arrivato a circa il 90% della distanza che lo separa dalla parte superiore della piastra (non lasciarlo annegare!).

A seconda del solvente, il solvente impiega dai 5 ai 20 minuti per percorrere i 2/3 della piastra di vetrino per microscopia. L’intensità della forza capillare dipende dal tipo di fase stazionaria e dalla tensione superficiale del solvente (e la tensione superficiale è funzione della polarità del solvente e dipende anche dalla composizione chimica del solvente). Man mano che la piastra si sviluppa, dovresti vedere crearsi un cromatogramma simile a quanto mostrato nella figura qui sotto.

Il cromatogramma via via che si sviluppa nel corso del tempo.

Prima che la piastra si asciughi, segna la parte anteriore dell’eluente (la linea sulla piastra che rappresenta il livello raggiunto dal solvente). Ne avrai bisogno per determinare il cosiddetto “fattore di ritenzione” (Rf) di ogni punto (spot) / composto (le lievi differenze nel fattore di ritenzione di un composto determinano una ritenzione differenziale sulla fase stazionaria e quindi influenzano la separazione). Dopodiché, asciuga la piastra (con aria compressa, aria che soffia o semplicemente aspetta). Scattane delle foto.

  1. Visualizza la piastra TLC: controlla i risultati!

Si tratta di trovare il modo giusto di visualizzare i punti corrispondenti a ciascun composto nella miscela appena separata. Se sono fortemente colorati, sei stato bravo! Non hai bisogno di nient’altro, basta guardare direttamente la piastra. Il più delle volte, i composti organici non saranno visibili, ma assorbiranno le radiazioni UV. Quindi usa una torcia o lampada UV. Infine, ci sono molte soluzioni di colorazione che possono essere utilizzate per sviluppare le piastre e dire facilmente dove appare ogni composto.

Reagenti coloranti che si possono scegliere per identificare i composti incolori.

Dovreste aver separato con successo l’inchiostro nero per pennarello in tre inchiostri. I migliori risultati sono stati ottenuti sulla piastra di amido di mais utilizzando il detergente per vetri come solvente. Abbiamo scoperto che l’inchiostro nero per pennarelli contiene almeno tre inchiostri colorati: rosso, blu e giallo. L’inchiostro giallo era il più mobile nel sistema cromatografico usato. Non siamo stati in grado di ottenere la completa separazione dei pigmenti nel nostro sistema cromatografico.

Separazione dell’inchiostro di un pennarello nero su una piastra TLC.

  1. Eventuali nuovi esperimenti raccomandabili

Le macchie di pigmento sono state macchiate lungo la piastra e sovrapposte. È una buona indicazione che il nostro sistema era lungi dall’essere perfetto anche se accettabile come cromatografia per ragazzi. Nel secondo stadio del nostro esperimento di cromatografia su strato sottile potreste verificare se i pigmenti usati nel pennarello nero (A) e nei pennarelli giallo (B) e rosso (D) siano gli stessi. Potreste anche indagare se l’inchiostro del pennarello verde (C) è un inchiostro o una combinazione di inchiostri.

Ci aspettavamo di vedere gli inchiostri gialli e rossi come gli inchiostri gialli e rossi nel pennarello nero. I risultati mostrano chiaramente che in effetti tutti gli inchiostri utilizzati nel pennarello nero sono diversi dagli inchiostri utilizzati in altri pennarelli, in quanto raggiungono distanze diverse sulla piastra! L’inchiostro del pennarello verde si è rivelato essere una composizione di inchiostri blu e gialli. Non siamo riusciti a ottenere la separazione completa di blu e giallo nel nostro sistema. L’inchiostro del pennarello giallo e il componente giallo del marcatore verde sembrano essere lo stesso inchiostro.

A sinistra il risultato dell’esperimento iniziale di cromatografia sul pennarello nero. A destra il secondo esperimento di cromatografia sui pennarelli giallo, verde e rosso. L’inchiostro del pennarello giallo e il componente giallo del marcatore verde sembrano essere lo stesso inchiostro.

Occorre rieseguire la cromatografia su strato sottile con un sistema a solvente migliore se il primo tentativo non ha avuto esito positivo. Infatti, ciò è qualcosa di molto comune quando si lavora con nuovi composti: molte volte la prima scelta del sistema solvente non sarà quella appropriata, e forse tutti i composti della miscela eluiranno insieme nella parte superiore del TLC, o semplicemente non si muoveranno dal punto base, o forse sono da qualche parte in mezzo, ma la separazione non è perfetta.

In uno di questi casi, devi solo continuare a modificare il sistema del solvente fino a trovare il più adatto alla tua miscela! Con il pennarello nero abbiamo ottenuto i migliori risultati con il detergente per vetri su piastre di amido di mais. Voi potreste ottenere risultati completamente diversi poiché i pennarelli prodotti da diverse società possono avere diverse combinazioni di inchiostri (e gli inchiostri possono avere una formula chimica diversa). Ma come determinare il fattore di ritenzione dei composti?

Come determinare il fattore di ritenzione dei composti

Nella cromatografia su strato sottile, il fattore di ritenzione (Rf) è la distanza percorsa da un composto attraverso la fase stazionaria (piastra TLC) tra il punto di origine e la distanza fino a cui il fronte del solvente si è spostato sopra l’origine. Per calcolare il valore di Rf, devi solo applicare questa semplice formula:

Rf (spot) = (distanza percorsa dal punto) / (distanza percorsa dal solvente)

Un esempio visivo della determinazione del fattore di ritenzione Rf nella cromatografia su strato sottile. Dopo aver eluito una miscela di benzaldeide e alcool benzilico in una piastra TLC usando una miscela 7:3 di pentano / etere dietilico come solvente, i due composti percorrono una certa distanza. La benzaldeide è meno polare dell’alcool corrispondente, quindi è facilmente identificabile come lo spot più in alto.

Come determinare il fattore di ritenzione (Rf) nella cromatografia su strato sottile.

Dopo aver misurato la distanza percorsa da entrambi i punti, possiamo determinare il fattore di ritenzione per ciascun composto in quella miscela di solventi. Basta dividere la distanza percorsa da un punto (spot) per la distanza totale percorsa dal solvente dalla linea del punto di origine. Ad esempio, lo spot di benzaldeide si è spostato di 3,2 cm dall’origine. Il solvente si è spostato in totale di 5 cm. Quindi possiamo determinare l’Rf della benzaldeide in pentano/dietil etere 7:3 come pari a 3,2 / 5 = 0,64.

Occorre tenere presente che i fattori di ritenzione dipendono fortemente dal sistema solvente utilizzato e dalla fase stazionaria della cromatografia su strato sottile. Se si modifica uno di questi, conseguentemente anche l’Rf cambierà. Ecco perché, quando si riportano i valori del fattore di ritenzione, risulta assolutamente essenziale specificare tali parametri per ciascun composto.