Come visualizzare il DNA con l’elettroforesi su gel

Supponiamo di aver appena fatto una reazione PCR, facendo molte copie del DNA o di una sua regione che ci interessa. Ora vuoi controllare e vedere se la tua PCR ha funzionato. La tecnica che puoi usare per visualizzare (osservare direttamente) i frammenti di DNA è l’elettroforesi su gel. L’elettroforesi comporta il passaggio di una corrente attraverso un gel contenente le molecole di interesse. In base alla loro dimensione e carica, le molecole viaggeranno attraverso il gel in direzioni diverse o a velocità diverse, permettendo loro di essere separate l’una dall’altra. Ecco come eseguirla.

L’elettroforesi su gel è una tecnica utilizzata per separare i frammenti di DNA (o altre macromolecole, come l’RNA e le proteine) in base alla loro dimensione e carica. La separazione delle molecole nell’elettroforesi si basa sulla carica e sull’efficace sezione trasversale della molecola in qualunque stato si trovi – piegata, aperta, legata ad altre molecole, etc. I frammenti di DNA vengono separati per lunghezza perché, in generale, l’unica differenza significativa tra i vari frammenti è la loro lunghezza.

Tutte le molecole di DNA, infatti, hanno la stessa quantità di carica per unità di massa. Per questo motivo, l’elettroforesi su gel dei frammenti di DNA li separa solo in base alle dimensioni. Usando l’elettroforesi, possiamo vedere quanti frammenti di DNA diversi sono presenti in un campione e quanto sono grandi l’uno rispetto all’altro. Possiamo anche determinare la dimensione assoluta di un pezzo di DNA esaminandolo accanto a un “metro” standard costituito da frammenti di DNA di dimensioni note.

Esempio di elettroforesi del DNA visualizzata poi su un transilluminatore in luce UV.

Tuttavia, ci sono alcune eccezioni a questa regola. Ad esempio, alcune molecole di DNA sono circolari (come i plasmidi batterici), mentre altre sono lineari. Le molecole di DNA circolari possono scorrere in modo diverso rispetto a quelle lineari attraverso un gel. I plasmidi, ad esempio, possono esistere in una forma chiamata “superavvolta”, in cui si muovono più velocemente attraverso un gel di quanto dovrebbero per le loro dimensioni, perché si sono trasformati in una forma più sottile.

Se abbiamo appena amplificato il DNA con una macchina per la PCR, in grado di moltiplicare il DNA così da produrne quantità utilizzabili in laboratorio – come abbiamo descritto nell’articolo Come fare la PCR per moltiplicare il DNA, che trovi qui – possiamo realizzare un’elettroforesi su gel, adattando facilmente l’attrezzatura per elettroforesi (senza gel) già illustrata nel nostro articolo Come fare l’elettroforesi di varie sostanze, che trovi qui. Rimandiamo quindi alla lettura preventiva di tale articolo.

Come fare l’elettroforesi su gel di agarosio

Come suggerisce il nome, l’elettroforesi su gel comporta l’uso di un gel: un materiale simile alla gelatina. I gel per la separazione del DNA sono spesso costituiti da un polisaccaride chiamato agarosio, che si presenta sotto forma di fiocchi secchi e in polvere. Quando l’agarosio viene riscaldato in un tampone (acqua con alcuni sali in esso) e lasciato raffreddare, si forma un gel solido. A livello molecolare, il gel è una matrice di molecole di agarosio che sono tenute insieme da legami idrogeno e formano minuscoli pori.

L’agarosio può essere facilmente acquistato su Internet.

A un’estremità, il gel ha rientranze simili a tasche chiamate “pozzi” (wells), dove verranno posizionati i campioni di DNA. Prima di aggiungere i campioni di DNA, il gel deve essere inserito su una piastra di vetro o di plastica per l’elettroforesi. Un’estremità della piastra è agganciata a un elettrodo positivo, mentre l’altra estremità è agganciata a un elettrodo negativo. Il corpo principale della scatola, in cui è posizionata la piastra con il gel, è riempito con una soluzione tampone salina che può condurre corrente.

L’estremità del gel con i pozzetti è posizionata verso l’elettrodo negativo. L’estremità senza pozzetti (verso la quale migreranno i frammenti di DNA) è posizionata verso l’elettrodo positivo. La soluzione salina dovrà essere o direttamente o indirettamente a contatto con il gel, ad esempio usando la carta assorbente come illustrato nel nostro articolo sull’elettroforesi. In teoria, la soluzione salina potrebbe essere fatta arrivare fino a metà dell’altezza del gel alle sue due estremità, in altri design dell’apparato.

Il semplice apparato per l’elettroforesi su gel. Puoi acquistare il materiale per l’elettroforesi direttamente online (ad esempio qui).

Una volta che il gel è sulla piastra, ciascuno dei campioni di DNA che vogliamo esaminare (ad esempio, ogni campione di una reazione di PCR) viene trasferito con cura in uno dei pozzetti. Un pozzo è riservato per una scala di DNA, un riferimento standard che contiene frammenti di DNA di lunghezze note. Le scale di DNA commerciali sono disponibili in diversi intervalli di dimensioni, quindi vorremmo sceglierne una con una buona “copertura” dell’intervallo di dimensioni dei nostri frammenti previsti.

Successivamente, viene alimentato il circuito dell’elettroforesi e la corrente inizia a fluire attraverso il gel. Le molecole di DNA hanno una carica negativa a causa dei gruppi fosfato nella loro spina dorsale zucchero-fosfato, quindi iniziano a muoversi attraverso la matrice del gel verso il polo positivo. Quando si accende l’alimentazione e la corrente passa attraverso il gel, il gel si dice che “migra”. I frammenti di ogni singolo campione analizzato iniziano a separarsi fra loro per dimensione.

Schema del più semplice apparato per l’elettroforesi (senza gel).

Come interpretare i dati: l’analisi elettroforetica

Infatti, mentre il gel migra, i pezzi di DNA più corti viaggeranno attraverso i pori della matrice del gel più velocemente di quelli più lunghi. Dopo che l’elettroforesi su gel ha funzionato per un po’, i pezzi più brevi di DNA saranno vicini all’estremità positiva del gel, mentre i pezzi più lunghi di DNA rimarranno vicino ai pozzetti. I pezzi di DNA molto corti potrebbero essere usciti dall’estremità del gel se lo avremo lasciato migrare troppo a lungo (qualcosa di cui siete sicuramente voi colpevoli!).

Una volta separati i frammenti, possiamo esaminare il gel e vedere quali dimensioni di bande si trovano su di esso. Quando un gel viene colorato con un colorante legante il DNA e posto alla luce ultravioletta (UV), i frammenti di DNA si illuminano, permettendoci di vedere il DNA presente in diverse posizioni lungo la lunghezza del gel. Una “linea” ben definita di DNA su un gel è chiamata banda.

Il “bp” accanto a ciascun numero nella scala in questa figura indica quante coppie di basi è lungo il frammento di DNA.

Ogni banda contiene un gran numero di frammenti di DNA della stessa dimensione che hanno viaggiato in gruppo nella stessa posizione. Un singolo frammento di DNA (o anche un piccolo gruppo di frammenti di DNA) non sarebbe visibile da solo su un gel. Confrontando le bande in un campione con la scala di riferimento del DNA, possiamo determinare le loro dimensioni approssimative. Ad esempio, la banda luminosa sul gel in figura è di circa 700 coppie di basi (bp) come dimensioni.

Si noti che l’analisi elettroforetica non ha nulla a che fare con il cosiddetto “sequenziamento” del DNA: quest’ultimo, infatti, è il processo per determinare la sequenza dei nucleotidi (As, Ts, Cs e Gs) in un pezzo di DNA. Nel metodo di sequenziamento di Sanger, ad esempio, il DNA bersaglio viene copiato molte volte, creando frammenti di diverse lunghezze. I nucleotidi “terminatori a catena” fluorescenti segnano le estremità dei frammenti e consentono di determinare la sequenza.

Oggi, con le attrezzature ed i materiali giusti, sequenziare un breve pezzo di DNA è relativamente semplice per i professionisti. Il sequenziamento di un intero genoma (cioè di tutto il DNA di un organismo) rimane invece un compito complesso. Infatti, richiede la suddivisione del DNA del genoma in molti pezzi più piccoli, il sequenziamento dei pezzi e l’assemblaggio delle sequenze in un’unica lunga catena. Comunque, è ora molto più veloce e meno costoso di quanto non fosse fino ad alcuni anni fa.

Più i frammenti di DNA sono grandi e meno migrano nel gel.

I coloranti per visualizzare e fotografare il DNA

Esistono diversi coloranti che possono essere utilizzati per visualizzare (e fotografare) il DNA dopo che il materiale è stato separato mediante elettroforesi su gel. Tra le molte scelte, questi cinque coloranti sono i più comuni, a cominciare dal bromuro di etidio, che è il più utilizzato. Quando si lavora con questo processo, è importante non solo conoscere le differenze tra i coloranti ma i rischi per la salute intrinseci. Pertanto, il loro uso va fatto con le necessarie cautele (guanti, etc.).

Bromuro di etidio

Il bromuro di etidio è probabilmente il colorante più noto usato per visualizzare il DNA. Può essere utilizzato nella miscela di gel, nel tampone di elettroforesi o per colorare il gel dopo che l’elettroforesi è partita. Le molecole del colorante aderiscono ai filamenti di DNA e diventano fluorescenti alla luce UV, mostrandoti esattamente dove si trovano le bande all’interno del gel. Nonostante il suo vantaggio, il rovescio della medaglia è che il bromuro di etidio è un potenziale cancerogeno, quindi deve essere maneggiato con grande cura.

SYBR Gold

Il colorante Oro di SYBR può essere usato per colorare il DNA a doppio o singolo filamento o per colorare l’RNA. L’oro di SYBR è stato lanciato sul mercato come una delle prime alternative al bromuro di etidio ed è considerato più sensibile. Il colorante mostra un aumento della fluorescenza UV 1.000 volte maggiore, una volta legato agli acidi nucleici. Penetra quindi in gel di agarosio densi e ad alta percentuale e può essere utilizzato nei gel di formaldeide. Poiché la fluorescenza della molecola non legata è così bassa, non è necessario decolorare.

Esempio di colorante per il DNA in vendita online.

SYBR Green

Il SYBR Safe e il SYBR Green sono alternative più sicure al bromuro di etidio. I coloranti SYBR Green I e II sono ottimizzati per scopi diversi. Poiché si legano al DNA, sono ancora considerati potenziali mutageni e per questo motivo dovrebbero essere maneggiati con cura. L’SYBR Green I è più sensibile all’uso con DNA a doppio filamento, mentre il SYBR Green II è migliore per l’uso con DNA a filamento singolo o RNA. Come la famosa colorazione al bromuro di etidio, questi coloranti altamente sensibili sono fluorescenti alla luce UV. Sia il SYBR Green I che il II sono raccomandati dal produttore per essere utilizzati con “pellicola in bianco e nero Polaroid 667 a illuminazione epossidica 254 nm e un filtro fotografico per colorante YBR Green”.

SYBR Safe

L’SYBR Safe è stato progettato per essere un’alternativa più sicura al bromuro di etidio e ad altri coloranti SYBR. Non è considerato un rifiuto pericoloso e può essere generalmente smaltito attraverso i normali sistemi fognari (ad es. nello scarico del water), poiché i test di tossicità indicano che non esiste tossicità acuta. I test indicano anche che c’è poca o nessuna genotossicità su cellule di embrioni di criceto siriano, linfociti umani, cellule di linfoma di topo. Il colorante può essere utilizzato con un transilluminatore a luce blu che causa meno danni al DNA visualizzato e offre una migliore efficienza per la successiva clonazione.

Un transilluminatore a luce blu che può essere acquistato direttamente su Internet.

Eva Green

L’Eva Green è un colorante fluorescente verde che inibisce la reazione a catena della polimerasi (PCR) in misura minore rispetto ad altri coloranti. Ciò lo rende molto utile per applicazioni come la PCR quantitativa in tempo reale. È anche una buona scelta se si utilizzano gel a basso punto di fusione per il recupero del DNA. È molto stabile alle alte temperature e ha una fluorescenza molto bassa quando è da solo, ma è altamente fluorescente quando è legato al DNA. È stato anche dimostrato che l’Eva Green ha citotossicità o mutagenicità molto basse o assenti.