Come studiare l’azione degli agenti antibatterici

La crescita dei batteri in una capsula di Petri non costituisce, di per sé, un esperimento scientifico. È un risultato interessante e affascinante, ma non soddisfa i requisiti di un progetto scientifico. Se vuoi fare un esperimento scientifico sui germi, devi aggiungere una variabile o qualcosa che cambia nell’esperimento. Ad esempio, l’azione sui batteri di antisettici, disinfettanti e antibiotici di uso comune è una variabile che può essere interessante studiare in dettaglio utilizzando colture di microrganismi consistenti di batteri in crescita. Descriveremo vari modi per farlo, di diversa difficoltà.

In che modo le persone impediscono ai batteri di crescere e diffondersi? Li controllano in due modi: uccidendo le cellule batteriche e bloccando la riproduzione dei batteri. Un agente è una soluzione o un metodo che uccide o ferma la riproduzione. I battericidi sono agenti che uccidono le cellule batteriche. Gli agenti statici, invece, inibiscono la crescita e la riproduzione delle cellule.

Esistono, in realtà, molti modi per uccidere i batteri o impedirne la riproduzione. I metodi fisici includono, in particolare, i seguenti: sterilizzazione (applicazione del calore per uccidere i batteri; include combustione, bollitura e cottura); pastorizzazione (l’uso di calore moderato per ridurre il numero di batteri in un alimento); temperature fredde (la refrigerazione e il congelamento sono due dei metodi più comuni utilizzati nelle case, per preservare la durata del cibo).

I metodi chimici, invece, includono i seguenti:

• Antisettici. Questi agenti possono essere applicati direttamente ai tessuti viventi, inclusa la pelle umana. Sono usati, ad esempio, per sterilizzare le ferite.
• Disinfettanti. Questi agenti non sono sicuri per i tessuti vivi. I disinfettanti ed i detergenti per la casa sono usati per pulire servizi igienici, lavandini, pavimenti, etc.
• Conservanti. Questi sono utilizzati in quasi tutti i prodotti alimentari trasformati disponibili oggi. Essi inibiscono la crescita batterica negli alimenti. Alcuni conservanti sono: benzoato di sodio, glutammato monosodico, anidride solforosa, sali, zucchero e fumo di legna.
• Antibiotici. Questi uccidono le cellule batteriche che si trovano nel corpo, senza danneggiare le cellule normali. Gli antibiotici sono spesso in grado di curare malattie una volta fatali, come la scarlattina. Tuttavia, possono uccidere i batteri buoni insieme a quelli cattivi.

Efficacia degli agenti: la “killer zone”

La crescita dei batteri in una capsula di Petri (che potete acquistare qui) può essere usata per testare l’efficacia degli agenti antibatterici. Basta infatti introdurre un agente antibatterico (disinfettante per le mani, sapone per bucato, candeggina, etc.) sulla capsula di Petri per testarne l’efficacia. Dopo aver introdotto i batteri nella capsula di Petri, utilizzate un tampone di cotone per posizionare una piccola goccia ad es. di gel disinfettante per le mani, di sapone disinfettante o candeggina al centro del campione di batteri, e continuate normalmente l’esperienza della crescita dei batteri illustrata nell’articolo che trovate qui.

Man mano che i batteri nella capsula di Petri crescono, dovresti vedere un anello o “alone” intorno al punto in cui hai collocato l’agente antibatterico, nel quale non crescono batteri. Questo alone è noto come “kill zone” (o più precisamente, “zona di inibizione”). È possibile misurare l’efficacia di diversi agenti antibatterici confrontando la dimensione della zone di inibizione in ciascuna capsula di Petri. Più ampia è la kill zone, infatti, e più efficace è l’agente antibatterico. Un primo esperimento in tal senso, dunque, può prendere in considerazione un paio di prodotti disinfettanti, giusto per iniziare.

Tipica zona di inibizione, o “kill zone”, prodotta da una goccia di agente antibatterico.

Prepara tre capsule di Petri: una come controllo (solo batteri), una con in più un disinfettante antibatterico e una terza capsula con un’altra marca di disinfettante antibatterico. Quindi puoi vedere quale disinfettante antibatterico è più efficace nell’uccidere i germi. Assicurati che tutte e tre le capsule di Petri raccolgano i germi nello stesso luogo della tua casa o della tua classe allo stesso tempo, così sai che siano tutte esposte agli stessi batteri. Anche le capsule devono essere coltivate ​​nello stesso luogo caldo e buio per lo stesso periodo di tempo, in modo che le condizioni siano il più possibile standardizzate.

Curate in modo maniacale la sicurezza prima, durante e dopo l’esperienza. Sebbene la maggior parte dei batteri presenti nell’ambiente non siano dannosi per gli individui sani, una volta concentrati nelle colonie possono essere pericolosi. Per ridurre al minimo i rischi, indossate guanti monouso durante la manipolazione dei batteri e lavatevi accuratamente le mani con un buon sapone disinfettante prima e dopo. Non mangiate né bevete durante gli esperimenti sui batteri, né inalate o ingerite colture in crescita. Lavorate in una stanza senza correnti d’aria e riducete il flusso d’aria il più possibile.

Conservate le capsule di Petri con i terreni di coltura coltivati con i batteri ​ben ​chiuse, preferibilmente chiuse con nastro adesivo, a meno che non vengano prelevati campioni o disinfettati. Anche in questo caso, rimuovete la capsula di Petri solo quanto basta per inserire l’attrezzo o il mezzo di distruzione (candeggina o alcool isopropilico al 70%). Al termine della sperimentazione, sigillate le capsule di Petri in una busta di plastica e smaltitele. Coprite gli sversamenti accidentali con candeggina o alcool per 10 minuti, quindi pulite accuratamente, sigillate i materiali sporchi in un sacchetto di plastica e sbarazzatevene.

Il metodo dei “quadrati di sensibilità”

Un metodo migliore per testare l’efficacia antibatterica di una sostanza consiste nell’utilizzare i cosiddetti “quadrati di sensibilità”. In pratica, tagliate dei quadretti , oppure dei dischetti, di carta assorbente (tipo Scottex oppure dei tovagliolini di carta), dopodiché immergeteli in qualsiasi sostanza di cui desiderate testare l’efficacia antibatterica: iodio, alcol etilico, sapone antibatterico, antisettici, aglio, etc.

Dischetto di sensibilità posto in una capsula di Petri e la zona di inibizione circostante.

Usate delle pinzette pulite (e sterilizzate passandole ogni volta per qualche secondo sulla fiamma di un fornello Bunsen o di un fornello a gas) per maneggiare i quadrati, in modo da non contaminarli l’uno con l’altro. Etichettali – o quanto meno numerali – con inchiostro permanente stando sempre attento a non toccarli con le dita o con altri oggetti potenzialmente contaminati, immergi poi i quadrati nella sostanza prescelta e asciuga il liquido in eccesso con un altro tovagliolo di carta.

A questo punto, scegliete una fonte per la raccolta di batteri. Per usare i quadrati di sensibilità, assicurati che ci sia una sola fonte e mantieni ogni capsula di Petri il più coerente possibile. Le fonti fra cui selezionare quella da usare potrebbero includere un lavello da cucina, un bancone del bagno, un telefono cellulare o un’altra superficie che vorreste testare. Strofina un cotton-fioc sterile sulla superficie prescelta, quindi sfiora leggermente la capsula con l’agar con uno schema a zigzag. Ruota la capsula e ripeti.

Veniamo ora all’impostazione di un esperimento vero e proprio. Ogni esperimento dovrebbe avere una capsula di controllo che mostri la crescita dei batteri in condizioni normali e uno o più capsule di test in cui si modificano determinate variabili per esaminare i risultati. Esempi di variabili da testare sono la presenza e il tipo di agenti antibatterici. In che modo i vari tipi che intendiamo testare influiscono sulla crescita dei batteri? Lo possiamo vedere molto semplicemente usando delle capsule di Petri.

Etichetta una capsula “Controllo”. Poi usa le pinzette per aggiungere, in ciascuna capsula del test, il quadrato di sensibilità immerso nella sostanza che desideri testare per le proprietà antibatteriche. È una buona idea aggiungere un semplice quadrato di carta assorbente privo di sostanze per vedere se la carta da sola ha qualche effetto sulla crescita dei batteri, quindi come ulteriore livello di controllo.

Per ottenere risultati migliori, utilizzate più capsule di test (una o più per ciascun tipo di agente antibatterico da testare) e controllate le variabili in modo che le condizioni siano identiche per ogni capsula: i batteri raccolti nello stesso luogo, esposti alla stessa quantità di sostanze antibatteriche, conservati alla stessa temperatura, etc. Più test esegui, più dati raccoglierai e più sarai sicuro delle tue conclusioni.

Metti tutte le capsule in un luogo buio (come ad es. una scatola) ed a temperatura ambiente. Attendi 3-7 giorni ed esamina la crescita dei batteri nelle capsule, senza rimuovere i coperchi. Vedrai più punti rotondi di crescita: queste sono colonie di batteri. A seconda di dove hai raccolto i campioni di batteri, potresti avere diversi tipi di batteri (e anche alcuni tipi di muffa!) che crescono nelle tue capsule. Diversi tipi di colonie avranno colori e trame diversi. Usa una lente di ingrandimento per guardarle meglio.

Spore di muffa coprono i batteri Staphilococcus in una capsula di Petri. Fu così che, nel 1928, Alexander Fleming scoprì per caso la pennicillina, il primo antibiotico.

Confronta poi la quantità di batteri nella capsula di controllo con la quantità nelle capsule di test. In seguito, confronta la quantità di crescita dei batteri attorno a ciascun quadrato di carta. Qual è il batterio che cresce più vicino ad esso? Qual è la quantità minima di batteri che cresce vicino ad esso? Se hai preparato più di una capsula di prova, i risultati sono simili in tutte le capsule di prova? In caso contrario, quali variabili potrebbero aver causato risultati diversi? In che modo ciò influenza le tue conclusioni?

L’esperimento della batteriostasi

Una zona di inibizione, prodottasi attorno ai quadratini imbevuti delle sostanze che vogliamo testare, può essere un’indicazione sufficiente che i batteri stessi siano sensibili a quel prodotto (ad es. contenente un particolare antibiotico). Il grado di sensibilità di un organismo può poi essere valutato misurando in maniera quantitativa le zone di inibizione, applicando possibilmente la seguente tabella.

Semplice tabella in cui possono essere riassunte le sensibilità di un microorganismo a una sostanza antibiotica, a concentrazione variabile.

Ciò si fa esponendo una serie di colture di un ceppo batterico innocuo, a concentrazione via via crescente su terreni di coltura preparati in capsule di Petri, all’azione delle sostanze chimiche antibatteriche che si intendono esaminare. È il cosiddetto esperimento della “batteriostasi”. Qualsiasi specie non patogena di batteri può venire usata per gli esperimenti di batteriostasi, e tali batteri possono venire acquistati presso molti laboratori di biologia, oppure presso ditte specializzate.

I dilettanti possono chiedersi della opportunità di acquistare dei batteri per questo esperimento, dal momento che è a tutti noto come vi sia un’estrema abbondanza di essi nell’aria che viene respirata. Ebbene, è effettivamente possibile tentare per un esperto una coltura di questo genere, avviandola con una semplice esposizione del terreno di coltura – da cui preleveremo i campioni a diversa concentrazione – all’aria esterna, su un balcone, e poi mantenendolo in incubazione per circa 24 ore.

Ci sia però permesso di far notare che questa soluzione potrebbe essere incontrollabile e pericolosa, per il fatto che con tale sistema non è possibile selezionare i batteri che si raccolgono e che possono fissarsi sul terreno di coltura dando luogo alla formazione di colonie. Il sistema può essere anche pericoloso, poiché può permettere il fissarsi di agenti patogeni, causa di gravi malattie, con gravi rischi non solo per lo sperimentatore ma anche per le persone che gli stanno attorno.

Pertanto, usando un ceppo innocuo e di facile approvvigionamento, lo si può coltivare normalmente in una capsula di Petri “progenitrice”. Data inoltre la costanza della specie batterica utilizzata, potrà essere possibile eseguire facilmente i confronti. Inoltre, per le colture acquistate, la spesa iniziale diviene ancora meno sensibile con il passare del tempo, poiché dai batteri di partenza possono ottenersi colonie per moltissimo tempo, data l’abilità di questi batteri a riprodursi.

Infatti, mantenendole a temperatura ambiente in un opportuno mezzo di coltura, e rinnovando le colonie stesse a giorni alternati – prendendo una “goccia” del vecchio terreno e introducendolo in una casula di Petri con del terreno di coltura ancora sterile – non è difficile conservare il ceppo innocuo. Inoltre, se la coltura può essere conservata a 5 °C in un frigorifero, il rallentamento della crescita dei batteri fa sì che il rinnovo delle colonie possa venire eseguito ogni settimana invece che ogni due giorni.

Tornando al nostro esperimento di batteriostasi, per preparare campioni di concentrazione decrescente, si trasferisce in una provetta con 9 ml di acqua sterilizzata in precedenza per bollitura, 1 ml di coltura preso dalla superficie del terreno coltivato con il ceppo innocuo. Mescolati coltura e acqua, si avrà il campione 1:10. Quello 1:100 si ottiene prelevando 1 ml di questa soluzione e aggiungendolo a un’altra provetta con 9 ml di acqua sterilizzata. E così via per le 4 diluizioni successive, fino a 1:1.000.000.

Come preparare campioni di concentrazione decrescente tramite diluizione.

Una volta preparati campioni di concentrazione decrescente, si provvede a contaminare altrettante triplette di capsule di Petri con tali campioni, con il solito cotton-fioc passato a zig-zag. Alla fine, le sei triplette di capsule di Petri (per un totale di 18 capsule) saranno state disseminate, a tre a tre, con campioni di concentrazione 1:10, 1:100; 1:1000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1.000.000. Tutte le soluzioni acquose rimaste nelle soluzioni titolate verranno sterilizzate e buttate via.

A questo punto si incubano per due giorni a 27 °C le 18 capsule di Petri all’interno di un recipiente antisettico. Trascorsi due giorni, si sterilizza, spruzzando un germicida, il contenitore in cui sono le capsule. Poi, quando le particelle del germicida si sono depositate, si prelevano le capsule e in ciascuna si applica – con pinzette sterilizzate di volta in volta alla fiamma – tre quadratini imbevuto dell’agente antibatterico scelto, ciascuna con una sua concentrazione diversa: 1:1, 1:10, 1:100.

Avendo una tripletta di capsule, possiamo testare tre agenti antibatterici diversi. Man mano che si svolge l’operazione si riapplica il coperchio alle varie capsule. Alla fine, le si ripongono in incubazione a 27 °C per altri 2 giorni. L’azione dei vari agenti antibatterici esaminata in funzione delle loro concentrazioni viene poi valutata osservando la continuazione della crescita dei microbi nelle singole capsule e le dimensioni degli anelli intorno a ciascun quadratino in cui la crescita è stata inibita.

Antibiotici posti in una capsula di Petri piena di batteri. In quella di sinistra (che è un cocktail di antibiotici) i batteri non si sviluppano vicino ai dischetti, invece quando gli antibiotici sono usati separatamente (capsula a destra) l’azione è meno efficace.

I risultati possono essere schedati anche adottando un segno “-” per indicare l’assenza di sviluppo della colonia stessa, ed un segno “+” per indicare l’effettiva inibizione alla vita. La presenza o l’assenza di una zona di inibizione – e non il diametro o l’area della zona stessa – sta ad indicare la sensibilità delle colture all’effetto degli agenti antibatterici testati. Se però nelle capsule di controllo, lasciate volutamente sterili, si verifica lo sviluppo di qualche colonia, ciò basta a invalidare l’intero esperimento.

Si raccomanda la supervisione di un adulto quando si lavora con i batteri.