Come realizzare una coltura cellulare

Molti campi della ricerca biomedica richiedono l’uso di cellule viventi per eseguire una varietà di test. La coltura tissutale è un modo per ottenere più cellule dai tessuti – ad esempio dei mammiferi – facendole crescere fuori dall’organismo, ottenendo una rapida crescita e proliferazione di diversi tipi di cellule per analisi sperimentali. Per fare questo è necessario creare un ambiente artificiale in cui le cellule cresceranno. Una volta che le cellule sono state coltivate, possono essere utilizzate in molti diversi tipi di studi, compresi – a livello professionale – studi sulla biochimica dei tessuti e lo sviluppo di farmaci.

La coltura cellulare è uno dei principali strumenti utilizzati nella biologia cellulare e molecolare, fornendo eccellenti sistemi modello per studiare la normale fisiologia e biochimica delle cellule (ad es. studi metabolici, sull’invecchiamento, etc.), gli effetti dei farmaci e dei composti tossici sulle cellule e la mutagenesi e cancerogenesi. Viene anche usata nello sviluppo di farmaci e vaccini. Il principale vantaggio dell’utilizzo della coltura cellulare per queste applicazioni è la coerenza e la riproducibilità dei risultati che possono essere ottenuti dall’uso di un lotto di cellule clonali.

È possibile coltivare cellule vegetali e animali. A volte le persone vogliono coltivare tessuti ottenuti direttamente da una pianta o un animale. Altre volte le cellule vengono coltivate da una linea cellulare precedentemente coltivata e immagazzinata, che si può acquistare presso ditte specializzate. Nuove culture possono essere create prelevando tessuti da un organismo. Queste cellule sono chiamate colture primarie. Si divideranno solo per un certo tempo finché non arriveranno alla senescenza.

La semplice vetreria usata per le colture cellulari, con fiasche, capsule di Petri, etc. Li puoi acquistare direttamente online, ad esempio qui.

Le colture cellulari di mammiferi sono colture cellulari che si riferiscono alla rimozione di cellule da un animale o pianta e alla loro successiva crescita in un ambiente artificiale favorevole, fino a quando non occupano tutto il substrato disponibile (cioè raggiungono la “confluenza”). Le cellule possono essere rimosse direttamente dal tessuto e disaggregate con mezzi enzimatici o meccanici prima della coltivazione, oppure possono essere derivate da una linea cellulare o da un ceppo cellulare preesistente.

Per lavorare con successo con le linee cellulari di mammiferi, le cellule devono essere coltivate in condizioni controllate e richiedono il proprio terreno di crescita specifico. Inoltre, per garantire la coerenza, la loro crescita va monitorata a intervalli regolari. Quando una linea cellulare raggiunge circa l’80% di confluenza (ovvero l’80% della superficie di una capsula di coltura è coperta di cellule), le cellule vanno “subcolturate” per garantire una crescita e una salute adeguate, trasferendole su una nuova capsula di Petri con un mezzo di crescita fresco per fornire più spazio per una crescita continua.

La tipica curva di crescita delle cellule in coltura. Prima che la crescita si arresti del tutto, va effettuata una “subcoltura”.

Linee cellulari “finite” e “continue”

Dopo la prima sottocoltura, la coltura primaria diventa nota come linea cellulare o subclone. Le linee cellulari derivate da colture primarie hanno una durata di vita limitata e, man mano che vengono passate – cioè subculturate – predominano le cellule con la più alta capacità di crescita, risultando in un grado di uniformità genotipica e fenotipica nella popolazione. Se una sottopopolazione di una linea cellulare viene selezionata mediante clonazione o altro metodo, questa linea cellulare diventa un ceppo cellulare.

Le cellule normali di solito si dividono solo un numero limitato di volte prima di perdere la loro capacità di proliferare, che è un evento geneticamente determinato noto come senescenza; queste linee cellulari sono conosciute come finite. Tuttavia, alcune linee cellulari diventano immortali attraverso un processo chiamato trasformazione, che può avvenire spontaneamente o può essere indotto chimicamente o viralmente. Quando una linea cellulare finita subisce trasformazione e acquisisce la capacità di dividere indefinitamente, diventa una linea cellulare “continua”.

Sul mercato si può quindi acquistare una linea cellulare già pronta continua, cioè che è stata modificata usando sostanze chimiche o virus, in modo che le cellule continuino a dividersi indefinitamente. Oppure, al contrario, si può realizzare una coltura cellulare da soli, seguendo un’opportuna procedura. In generale, la prima cosa da fare per realizzare una coltura è preparare l’ambiente colturale.

Cellule epiteliali primarie dell’intestino umano.

Le condizioni saranno diverse per i diversi tipi di cellule, ma in generale la coltura richiederà:

  • Una temperatura controllata. La temperatura migliore varierà in base al tipo di cellule in crescita, ma probabilmente sarà compresa tra 20 e 45 °C.
  • Un pH controllato. Il miglior pH sarà probabilmente tra 6.0 e 7.5.
  • Una pressione osmotica controllata
  • Uno scambio adeguato di ossigeno e anidride carbonica
  • Ormoni
  • Fattori di crescita
  • Un substrato che fornirà alle cellule i nutrienti di cui hanno bisogno. Ciò include aminoacidi, carboidrati, vitamine e minerali.
  • Luce. Essa è cruciale se si coltivano cellule vegetali che devono essere foto-sintetizzate

Dovrai inoltre decidere quale tipo di supporto fornirai. La maggior parte delle cellule dipende dall’ancoraggio e deve essere coltivata mentre è attaccata a un substrato solido o semisolido (coltura aderente o monostrato), mentre altre possono essere coltivate fluttuando nel terreno di coltura (coltura in sospensione). I possibili tipi di substrati includono:

  • Un substrato solido, chiamato anche aderente. I tessuti ottenuti da organi come i reni sono generalmente aderenti perché fissati nel tessuto connettivo.
  • Un substrato semi-solido o monostrato. Questi tipi di colture generalmente formano uno strato della profondità di una cellula sul fondo.
  • Una coltura di sospensione. Le cellule di questo tipo non hanno bisogno di essere ancorate al substrato e cresceranno invece fluttuando. Le cellule del sangue vengono spesso coltivate in sospensione.

Una fiasca usata per la coltura di cellule.

Se acquisti una linea cellulare da una ditta specializzata, segui i protocolli del produttore per iniziare la coltura. Esistono diverse aziende che forniscono ai laboratori materiali e attrezzature per condurre colture. Quando acquisti i materiali, verranno forniti anche dei protocolli per iniziare la coltura. Questi protocolli descriveranno esattamente come si dovrebbe trasferire il campione che si desidera coltivare nell’ambiente colturale. Diverse aziende ben note includono: Qiagen, Fisher Scientific, Thermo Scientific.

Nutri le cellule, se stai lavorando con cellule di mammifero. È generalmente necessario ricostituire i terreni di coltura ogni 2-3 giorni. Segui i protocolli del produttore per alimentare le cellule. Questo processo dovrebbe durare 20 minuti o meno. Se non fornisci sufficienti nutrienti, le cellule che hai moriranno. Le colture cellulari, via via che le cellule si dividono, tendono a diventare affollate. Come fare?  Occorre spostare alcune cellule in una nuova capsula di Petri con una densità inferiore. Ciò consentirà sia alla coltura originale che a quella nuova – la subcoltura – di continuare a crescere.

L’attrezzatura di laboratorio necessaria

Tutti i laboratori di coltura cellulare hanno il requisito comune di essere privi di microrganismi patogeni e di condividere alcune delle stesse attrezzature di base che sono essenziali per la coltura delle cellule, molte delle quali possono venire auto-costruite da uno scienziato dilettante:

  • Cappa per coltura cellulare (ovvero cappa a flusso laminare)
  • Incubatrice – Vedi il nostro articolo qui
  • Bagnomaria
  • Centrifuga – Vedi il nostro articolo qui
  • Frigorifero e congelatore (–20 ° C)
  • Contatore di cellule (o emacitometro) – Vedi il nostro articolo qui
  • Microscopio invertito
  • Contenitore congelatore ad azoto liquido (N2)
  • Sterilizzatore – Vedi il nostro articolo qui

Il requisito principale di un laboratorio di coltura cellulare è la necessità di mantenere un’area di lavoro asettica limitata al lavoro di coltura cellulare. Anche se una stanza di coltura tissutale separata è preferibile, è ancora possibile utilizzare un’area di coltura cellulare designata per la gestione sterile, l’incubazione e la conservazione di colture cellulari, reagenti e terreni sterili. Il modo più semplice ed economico per fornire condizioni asettiche consiste nell’utilizzare una cappa per la coltura cellulare.

Cappa per coltura cellulare usata normalmente nei laboratori di biologia cellulare.

La cappa per coltura cellulare serve a ridurre la contaminazione da particelle sospese nell’aria ed aerosol (ad es. polvere, spore, pelle secca, starnuti). La cappa deve essere correttamente installata e collocata in un’area che sia limitata alla coltura cellulare e libera da correnti d’aria da porte, finestre e altre attrezzature e senza traffico passante. La superficie di lavoro deve essere ordinata e contenere solo gli elementi richiesti per svolgere la procedura particolare che ci interessa effettuare.

Lo scopo dell’incubatrice è di fornire l’ambiente appropriato per la crescita delle cellule. L’incubatrice dovrebbe essere abbastanza grande per le esigenze del laboratorio, avere una circolazione forzata e avere un controllo della temperatura entro ± 0,2 ° C. Le incubatrici in acciaio inossidabile consentono una facile pulizia e offrono protezione dalla corrosione, soprattutto se è richiesta aria umida per l’incubazione. Una frequente pulizia dell’incubatrice è essenziale per evitare la contaminazione delle colture.

Esistono due tipi base di incubatrici: incubatrici asciutte e incubatrici a CO2 umide. Quelle asciutte sono più economiche, ma richiedono l’incubazione delle colture cellulari in boccette sigillate per evitare l’evaporazione. Posizionare un piatto d’acqua in un’incubatrice asciutta può fornire un po’ di umidità, ma non consente un controllo preciso delle condizioni atmosferiche nell’incubatrice. Le incubatori a CO2 umide sono più costose, ma consentono un controllo superiore delle condizioni della coltura.

Un esempio di incubatrice da laboratorio in cui far crescere la coltura cellulare.

Puoi anche congelare alcune culture per lavori futuri o per ripetere esperimenti in caso di futuri problemi con la contaminazione. In pratica, se un surplus di cellule è disponibile dalla sottocultura, devono essere trattati con l’agente protettivo appropriato (ad es. DMSO o glicerolo) e conservati a temperature inferiori a -130 ° C (crioconservazione) fino a quando non sono necessari. Segui i protocolli forniti dal produttore per determinare la temperatura per la crioconservazione o il congelamento delle colture.

Consigli ai dilettanti per la coltura cellulare

La coltura cellulare può essere una delle attività di laboratorio più ordinarie, ma molte volte si rivela anche estremamente frustrante. Le cellule coltivate nei laboratori sono organismi viventi, ma non sono in grado di urlarvi ciò che le disturba. Invece, ricorrono a comportamenti imbronciati: cambiano aspetto, rifiutano di crescere e infine muoiono. Fortunatamente, si possono fare molte cose per mantenere le cellule in vita e felici. Innanzitutto, evitate a tutti i costi la contaminazione!

Ci sono molti agenti patogeni opportunisti là fuori che aspettano solo di invadere la tua coltura: funghi, batteri, virus e persino altre linee cellulari. L’invasione su larga scala è di solito abbastanza ovvia: il mezzo diventa torbido e ha un cattivo odore e gli organismi invasori possono essere osservati al microscopio o anche a occhio nudo. Altre volte, gli unici segni di contaminazione sono i cambiamenti nei parametri di crescita e l’aspetto delle cellule. La contaminazione su vasta scala probabilmente causerà la morte cellulare, mentre la contaminazione di basso livello potrebbe alterare i risultati dei tuoi esperimenti.

Immagine in contrasto di fase di una coltura cellulare contaminata da lieviti, le piccole particelle dalla forma ovoidale indicate dalle frecce.

È quindi della massima importanza mantenere le colture cellulari libere da invasori. Ecco come ottenerlo:

  • Lavati le mani prima e dopo aver lavorato sulle colture. Tieni i capelli legati ed evita di toccare viso, bocca e capelli. Indossa sempre i guanti. Indossa un camice da laboratorio pulito che deve essere utilizzato solo nella stanza di coltura cellulare.
  • Spruzza liberamente il 70% di etanolo sulle mani, sui piani di lavoro e su tutto ciò che verrà a contatto con le tue mani o con le colture. Non uccide tutto, ma uccide moltissimo. Ricorda che tutte le forniture e i reagenti che vengono a contatto con le colture devono essere sterili. In caso di dubbi, non utilizzarlo: è meglio prevenire che curare.
  • Evita l’uso a lungo termine di antibiotici. Può sembrare una buona idea, ma a lungo termine può portare a una persistente contaminazione di basso livello.
  • Mantieni pulite le tue incubatrici e i tuoi bagni d’acqua, che spesso sono fonte di contaminazione.

Prima e dopo l’uso, la superficie di lavoro deve essere disinfettata a fondo e le aree e le attrezzature circostanti devono venire pulite. Per la pulizia ordinaria, pulisci la superficie di lavoro con etanolo al 70% prima e durante il lavoro, soprattutto dopo qualsiasi sversamento. È possibile utilizzare la luce ultravioletta per sterilizzare l’aria e le superfici di lavoro esposte nella cappa. L’uso di un bruciatore Bunsen per fiammeggiare non è necessario né raccomandato in una cappa per coltura cellulare. Lascia sempre attiva la cappa, spegnendola solo quando non si desidera utilizzarla per lunghi periodi di tempo.

Dopo un periodo di tempo imparerai come appaiono le cellule sane, qual è il loro tasso di crescita tipico e con quale frequenza si dividono. È una buona idea tenere un registro delle colture cellulari in cui è necessario registrare il numero di passaggio (un numero di passaggio è il numero di volte in cui una coltura cellulare è stata subcolturata), la data del passaggio, la densità e la vitalità delle cellule, il rapporto di divisione e qualsiasi altra informazione importante: aspetto cellulare insolito, nuovo lotto di supporti etc. In questo modo si è in grado di individuare eventuali deviazioni dal modello di crescita stabilito.

Schema che porta alle colture cellulari secondarie, che permettono esperimenti in vitro.

Siamo stati tutti dilettanti all’inizio. Ed anche gli scienziati esperti a volte hanno avuto (o hanno ancora) problemi con le loro cellule, le quali sono temperamentali e sensibili allo stesso tempo. A volte solo piccole modifiche possono fare un’enorme differenza per il benessere degli organismi più piccoli – tipo di plastica errato, diversi lotti di media o siero, temperatura o velocità di aerazione leggermente diversi, etc. – et voilà, si verificano disastri. Quindi non scoraggiarti, è solo una parte della vita dello scienziato!

Avvertenze. Un laboratorio di coltura cellulare ha un numero di pericoli specifici associati alla manipolazione di cellule e tessuti umani o animali, nonché si solventi e reagenti tossici, corrosivi, o mutageni. Il più comune di questi pericoli è la foratura accidentale con aghi da siringa o altri oggetti taglienti, schizzi contaminanti sulla pelle e sulle mucose, l’ingestione attraverso il pipettaggio della bocca e l’esposizione per inalazione ad aerosol infettivi. Occorre quindi ridurre o eliminare l’esposizione delle persone nel laboratorio e nell’ambiente esterno ad agenti biologici potenzialmente dannosi.

L’elemento più importante della sicurezza in un laboratorio di coltura cellulare è la stretta aderenza alle pratiche e tecniche microbiologiche standard, che si trovano in apposite guide. Il livello di biosicurezza 1 (BSL-1) è il livello base di protezione comune alla maggior parte dei laboratori di ricerca e clinici, ed è appropriato per agenti che non sono noti causare malattie, in condizioni normali, agli esseri umani sani. Il livello di biosicurezza 2 (BSL-2) è invece appropriato per agenti a rischio moderato che sono noti causare malattie umane di varia gravità per ingestione o esposizione percutanea o delle mucose.