Come osservare gli insetti al microscopio

Gli insetti ed i loro parenti prossimi sono soggetti molto carini per un esame più attento al microscopio. Ma a causa delle loro dimensioni non è possibile osservare un insetto vivo al microscopio normale. Un microscopio stereo a bassa potenza (microscopio da dissezione), o uno digitale USB, è più adatto a tale scopo. Con un tale microscopio si ottiene un’immagine stereoscopica (3D) dell’insetto. Lo studio della morfologia di diversi tipi di insetti costituisce certamente uno dei modi più semplici, economici e facilmente accessibili per ottenere una comprensione della biodiversità del pianeta.

Gli insetti sono esemplari perfetti da esaminare da vicino al microscopio. In genere un microscopio stereo a bassa potenza è il migliore per la visualizzazione di insetti, perché fornirà un’immagine 3D. Una volta visualizzati gli insetti al microscopio da dissezione, è possibile visualizzare ulteriori dettagli su una parte specifica dell’insetto. In questo caso, dovrai sezionare l’insetto e preparare un vetrino. Ciò consentirà di visualizzare un campione piatto al microscopio biologico, che ha un ingrandimento maggiore.

È inoltre necessario preparare un vetrino perché, quando si utilizza un microscopio biologico, il campione deve essere traslucido (per consentire alla luce di attraversarlo). Un microscopio da dissezione stereo ha luce sopra e sotto il palco, mentre un microscopio biologico ha solo luce che brilla da sotto il palco. Se stai appena iniziando a visualizzare gli insetti con il microscopio e hai accesso a un solo tipo di microscopio, si consiglia di iniziare con uno microscopio stereo da dissezione di base.

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Un buon microscopio è essenziale per una seria identificazione degli insetti. Molti stili e marchi sono disponibili nei cataloghi dei fornitori. Cerca ottiche di qualità e ingrandimenti da 6x a 25x o più. Gli strumenti per principianti sono adeguati per la maggior parte degli studenti, ma se si desidera lavorare con esemplari molto piccoli (5 mm o meno) o non si è soddisfatti della risoluzione del proprio strumento, potrebbe essere necessario spendere più denaro per un microscopio di qualità.

In alternativa – o, meglio ancora, in aggiunta a questi due tipi di microscopi – si può usare un microscopio digitale USB, ottimo per iniziare l’osservazione di insetti in 3D avendo la possibilità di raggiungere un ingrandimento elevato (dell’ordine di 1000x) ma con un costo di acquisto contenuto (puoi trovare vari modelli economici qui). Ad ogni modo, per una guida pratica sulla scelta del microscopio rimandiamo al nostro articolo Come scegliere un microscopio: ottico o digitale?, che puoi trovare qui.

Osservazione degli insetti con un microscopio digitale USB, che può arrivare fino a circa 1000 ingrandimenti. Ne trovi di molto economici qui.

Preparazione e montaggio dei vetrini

Se ti piace studiare gli insetti e i loro parenti in modo più dettagliato, devi analizzarli e preparare un vetrino. La ragione di ciò è che è necessario un campione molto piatto per poter vedere ogni dettaglio al microscopio. Con un ingrandimento così forte la profondità di campo diventa molto bassa. Quando si appiattisce il campione, tutti i dettagli vengono messi a fuoco. Un altro motivo per realizzare un vetrino è che il campione deve essere traslucido poiché si lavora con la luce incidente.

Lo scheletro esterno (esoscheletro) degli insetti può essere reso morbido e traslucido usando sostanze chimiche. Ma si consiglia di non iniziare a uccidere sempre gli insetti. Molte caratteristiche interessanti possono essere viste negli animali vivi: ad esempio le caratteristiche anatomiche. Cattura un insetto, osservalo in un piccolo contenitore di vetro o una capsula di Petri con un obiettivo manuale 8x o un microscopio stereo e rilascialo in seguito, a meno che tu non voglia conservarlo.

La dissezione dei campioni e i preparati per la ricerca morfologica mediante microscopia ottica sono avvantaggiati dalla pulizia della cuticola – la sottile membranella indifferenziata che serve a delimitare o separare formazioni anatomiche o tessuti diversi – mediante soluzioni alcaline, come l’idrossido di sodio (NaOH) o di potassio (KOH). Lo schiarimento è particolarmente utile quando si esaminano le proiezioni interne dell’esoscheletro, ma questo processo rende anche le caratteristiche esterne del tegumento – come alcune suture e sulci – più facilmente disponibili per l’osservazione.

L’idrossido di potassio può facilmente essere acquistato sul web, ad es. qui.

Sebbene le soluzioni alcaline (ad es. NaOH o KOH) siano comunemente utilizzate nelle procedure di schiarimento entomologico dai ricercatori che lavorano con vari taxa di insetti, i trattamenti con questi tipi di basi possono eventualmente essere associati a quelli con il perossido di idrogeno (H2O2) – ovvero l’acqua ossigenata – una soluzione intesa a rendere il tegumento dell’insetto più traslucido. Si tratta del cosiddetto “metodo di schiarimento di Melo”, proposto da Melo nel 1999.

I vetrini possono essere preparati facilmente attraverso il “montaggio” che ora illustreremo e che varia a seconda delle dimensioni del’insetto: nei campioni più piccoli, ad esempio, non è necessario sciogliere i tessuti molli in KOH o NaOH perché il mezzo usato per il montaggio – di solito l’Euparal, un liquido “montante” usato nella microscopia – lo fa da solo. È anche possibile acquistare dei bellissimi vetrini di parti del corpo o di insetti interi già pronti per essere osservati al microscopio biologico.

Per il montaggio permanente puoi quindi usare l’Euparal, e se l’insetto è piccolo puoi metterlo direttamente nell’alcool etilico a 90% e poi nell’Euparal. Se è più grande e molto scuro, potrebbe essere necessario metterlo prima, per un po’ di tempo, in una soluzione alcalina (KOH o NaOH), dopodiché nell’alcool (perché non è possibile mettere il campione nell’Euparal direttamente dalla soluzione acquosa). Quindi i passaggi, in generale, sono i seguenti: 1) soluzione KOH -> 2) Alcool etilico -> 3) Euparal.

Esempio di campioni di insetti in vendita su Internet. Per i vetrini pronti vedi qui.

Ecco una procedura economica ma professionale per effettuare il montaggio:

1. Posiziona il campione in un vetrino da orologio, aggiungi alcune gocce di acqua distillata, e poi un numero uguale di gocce di soluzione NaOH (o KOH) al 5%, che serve a dissolvere i tessuti molli. I campioni pallidi possono richiedere solo un’ora, altri possono essere lasciati una notte, i campioni neri possono essere lasciati per 2 o più giorni.
2. Trasferisci i campioni dalla soluzione di NaOH in acqua distillata per alcune ore, poi in etanolo (in pratica, il comune alcool etilico) al 60%.
3. Conserva i campioni in etanolo al 60% per 24 ore.
4. Sostituisci l’etanolo al 60% con etanolo al 70% e lascia per circa 1 ora.
5. Sostituisci con etanolo all’80% e lascia per 20 minuti.
6. Sostituisci con etanolo al 95% e lascia per 10 minuti.
7. Sostituisci con etanolo assoluto e lascia per 5 minuti.
8. Sostituisci con etanolo assoluto fresco e lascia per altri 5 minuti.
9. Trasferisci nell’olio di chiodi di garofano e lascia per circa mezz’ora, o fino a completo svuotamento, prima del montaggio.

Dissezione e conservazione dei campioni

Parti delicate del campione – come parti della bocca e terminazioni – possono essere sezionate / disarticolate prima di eventuali schiarimenti con perossido di ossigeno per evitare di dissolverle troppo. Inoltre, la testa e il propectus, mesosoma e metasoma possono essere separati prima delle fasi successive. Ciò consente la messa a punto del processo di schiarimento per parti distinte del corpo, poiché normalmente hanno proprietà diverse (ad es. spessore della cuticola, colori, etc.).

Kit di strumenti di dissezione utilizzabili per gli insetti in vendita online, ad es. qui.

Prima di iniziare il processo di schiarimento chimico di un campione, è consigliabile rimuovere le ali. Non vi è alcun danno nel lasciarle attaccate al campione, specialmente quando si prevede che verrà effettuato uno studio della sua struttura microscopica, ma potrebbero venire completamente deformate. Si raccomanda che un’ala della coppia sia montata permanentemente in vetrini per lo studio in microscopia ottica e l’altra ala sia incollata in un pezzo di carta e fissata con le etichette dei campioni, in modo che questi possano essere correttamente conservati per ulteriori registrazioni.

In realtà ci sono diverse opzioni disponibili sul mercato in alternativa all’Euparal, e puoi scegliere quella più adatta alle tue applicazioni o confrontare i prezzi. Ecco qui alcune di esse: 1) Supporto di montaggio Fisher Chemical Permount; 2) Eukitt® Mezzo di montaggio a rapido indurimento; 3) Entellan. Si può anche usare l’olio di chiodi di garofano dopo l’alcol, in quanto fornisce elasticità (diminuita dall’alcol) alla cuticola e puoi finire la dissezione dell’insetto senza pericolo di romperla.

Campioni di Scaptotrigona depilis: habitus laterale (colonna centrale, in alto); habitus dorsale (colonna centrale, metà); diverse parti del corpo disarticolate, insieme ad esempi di strutture esterne / interne rese disponibili per raffinate ispezioni morfologiche.

I campioni di insetti possono venire conservati anche in glicerina, composta per il 95% da glicerolo. La proprietà traslucida di molti mezzi liquidi – in particolare il glicerolo – rende i campioni schiariti e le loro parti disponibili per ispezioni ottiche, disegni o fotodocumentazione. Durante le indagini morfologiche e quando si utilizza una fotocamera, il contrasto può essere notevolmente migliorato alterando la tecnica di trasmissione della luce, variando tra campo luminoso e campo scuro.

Si noti che la procedura di trasferimento al glicerolo puro deve essere eseguita in modo graduale, poiché l’etanolo e il glicerolo non si mescolano perfettamente a causa delle loro densità distinte. L’aggiunta di glicerolo può essere effettuata in una o due volte, fino a quando quasi l’etanolo idratato (EtOH) è stato rimosso, prima della conservazione permanente in glicerina (glicerolo) pura. Se il bagno in etanolo non era al 60% ma al 95-100%, non è necessaria la gradualità nel riporre il campione nella glicerina.

La conservazione a lungo termine dei campioni schiariti e dissezionati può essere facilmente ottenuta conservando ciascuno di essi in singoli pozzetti delle piastre di coltura cellulare in acrilico (chiamate anche “piastre di coltura tissutale”). Lo stoccaggio permanente in piastre di coltura impone alcune restrizioni per il trasporto dei campioni. Quando si tratta di brevi distanze, le piastre possono essere facilmente trasportate a mano purché non siano fortemente inclinate o scosse durante il processo. In condizioni normali, possono anche essere trasportate in auto, se necessario.

Piastre di coltura cellulare utilizzabili per la conservazione dei campioni.

Osservazione dei campioni al microscopio

Una volta preparato il vetrino, possiamo osservarlo con un microscopio composto standard con ingrandimenti che possono andare da 40x a 1000x. Questo è esattamente lo strumento giusto per visualizzare oggetti montati su vetrini. Quindi, è possibile montare e visualizzare piccoli insetti o parti di quelli più grandi. Ma spesso è molto più soddisfacente e intuitivo usare un microscopio stereo da dissezione con oculari da 10x e obiettivi fissi o zoom per un ingrandimento finale di 10-30x o 50x.

È possibile utilizzare tale microscopio per visualizzare i vetrini e, a causa della grande distanza di lavoro, è ancora più adatto per interi insetti. Alcuni laboratori di biologia delle scuole superiori dispongono di tali strumenti, in caso contrario dovrebbero. Un’alternativa è un microscopio digitale USB, che vi permetterà di osservare i dettagli in 3D di un insetto fino a circa 1000 ingrandimenti. In tali microscopi l’ingrandimento dipende dalle dimensioni dello schermo usato per la visualizzazione.

Lo studio del campione sotto luce riflessa e trasmessa può essere facilmente eseguito direttamente sulle capsule di Petri grazie alle loro pareti trasparenti. Tali piastre di coltura sono prodotte con pozzetti di diametri distinti e devono essere scelte in base alla dimensione dei campioni. Tuttavia, il diametro minimo dei singoli pozzetti non deve essere inferiore a 15 mm, anche se vengono utilizzati per conservare piccoli campioni. Diametri più piccoli rendono difficile spostare le parti del campione sezionate osservandole contemporaneamente al microscopio da dissezione.

Una mosca Cleg è una meraviglia se esaminata al microscopio stereo. Gli occhi composti mostrano schemi e colori intrinseci. Queste mosche succhiasangue sono facili da trovare.

In alcuni casi, quando la distanza focale del microscopio è molto breve, queste piastre possono rendere difficile la manipolazione dei campioni. In questo caso, l’uso di strumenti manipolativi – come un bastoncino di legno con un perno attaccato alla sua punta o qualcosa di simile – può aiutare a superare il problema di una breve distanza focale. In alternativa, i campioni possono essere trasferiti su piastre in ceramica o vetro, ma il primo non consente l’uso della luce trasmessa e il secondo è spesso costoso.

In quest’ultimo caso, una piccola capsula di Petri può costituire un’alternativa più economica. L’esame con manipolazione concomitante di più campioni da una singola piastra o da piastre diverse richiede un’attenzione particolare da parte dello sperimentatore per evitare che le parti osservate non vengano mescolate tra i pozzetti. Se non strettamente osservati, le parti del campione possono rimanere attaccate a goccioline di glicerina sulle punte degli strumenti di manipolazione.