Come misurare le proteine col test di Bradford

Il test di Bradford delle proteine è uno dei numerosi metodi semplici comunemente usati per determinare la concentrazione proteica totale di un campione. Il metodo si basa sul legame proporzionale del colorante Coomassie alle proteine. All’interno dell’intervallo lineare del test (5-25 mcg/mL), maggiore è la presenza di proteine, maggiore è il legame con il Coomassie. Inoltre, il dosaggio è colorimetrico: all’aumentare della concentrazione proteica, il colore del campione diventa più scuro. Il Coomassie assorbe a 595 nm, per cui la concentrazione delle proteine può venire stimata con l’aiuto di uno spettrofotometro.

Le proteine sono composti organici che contengono l’elemento azoto, nonché carbonio, idrogeno e ossigeno. Le proteine sono il gruppo più diversificato di sostanze biologicamente importanti e sono spesso considerate il composto centrale necessario per la vita. In effetti, la traduzione dalla parola radice greca significa “primo posto”. Pelle e muscoli sono composti da proteine; gli anticorpi e gli enzimi sono proteine; alcuni ormoni sono proteine; e alcune proteine sono coinvolte nella digestione, nella respirazione, nella riproduzione e persino nella visione normale, solo per citarne alcune.

Nel test di Bradford delle proteine, la concentrazione proteica del campione che ci interessa viene determinata rispetto a quella di una serie di standard proteici noti per esibire in modo riproducibile un profilo di assorbanza lineare in questo test. Sebbene possano essere utilizzati diversi standard proteici, la proteina più utilizzata come standard è l’albumina sierica bovina (BSA). Ma vediamo ora più in dettaglio cosa è il test di Badford delle proteine e come lo si esegue in pratica.

Cosa è il test di Bradford delle proteine

Il cosiddetto “test di Bradford delle proteine” è stato sviluppato da Marion M. Bradford nel 1976. È una procedura analitica spettroscopica rapida e accurata utilizzata per misurare la concentrazione di proteine in una soluzione. La reazione dipende dalla composizione aminoacidica delle proteine misurate. Il test di Bradford, un test colorimetrico delle proteine, si basa in pratica su uno spostamento di assorbanza del colorante “Coomassie Brilliant Blue G-250”.

Il Coomassie Brilliant Blue G-250, il colorante legante per il test di Bradford.

Il colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 esiste in tre forme: anionico (blu), neutro (verde) e cationico (rosso). In condizioni acide, la forma rossa del colorante viene convertita nella sua forma blu, legandosi alla proteina da saggiare. Se non ci sono proteine ​​da legare, la soluzione rimarrà marrone. Il colorante forma un complesso forte e non covalente con il gruppo carbossilico della proteina dalla forza di van der Waals e il gruppo amminico attraverso interazioni elettrostatiche.

Durante la formazione di questo complesso, la forma rossa di colorante Coomassie dona innanzitutto il suo elettrone libero ai gruppi ionizzabili sulla proteina, causando un’interruzione dello stato nativo della proteina, esponendo di conseguenza le sue tasche idrofobiche. Queste tasche nella struttura terziaria della proteina si legano in modo non covalente alla regione non polare del colorante attraverso la prima interazione di legame (forze di van der Waals).

Queste forze di van der Waals posizionano i gruppi amminici positivi in ​​prossimità della carica negativa del colorante. Il legame fra proteine e colorante è ulteriormente rafforzato dalla seconda interazione di legame tra i due: l’interazione ionica. Il legame della proteina stabilizza la forma blu del colorante Coomassie; quindi la quantità del complesso presente in soluzione è una misura per la concentrazione proteica e può essere stimata usando una lettura dell’assorbanza.

Schema del test di Bradford delle proteine.

La forma cationica (non legata) è verde / rossa e ha uno spettro di assorbimento massimo storicamente ritenuto pari a 465 nm. La forma anionica legata del colorante che è tenuta insieme da interazioni idrofobiche e ioniche, ha uno spettro di assorbimento massimo storicamente ritenuto di essere a 595 nm. L’aumento dell’assorbanza a 595 nm è proporzionale alla quantità di colorante legato e quindi alla quantità (concentrazione) di proteine ​​presenti nel campione.

Molte soluzioni contenenti proteine hanno il massimo assorbimento nello spettrofotometro a 280 nm, cioè nella gamma UV. Ciò richiede spettrofotometri in grado di misurare nell’intervallo UV, cosa che molti non possono fare. Inoltre, i massimi di assorbimento a 280 nm richiedono che le proteine contengano aminoacidi aromatici come tirosina (Y), fenilalanina (F) e / o triptofano (W). Non tutte le proteine contengono questi aminoacidi, un fatto che distorcerà le misurazioni della concentrazione.

Se nel campione sono presenti acidi nucleici, essi assorbirebbero anche la luce a 280 nm, distorcendo ulteriormente i risultati. Usando il test delle proteine di Bradford, si possono evitare tutte queste complicazioni semplicemente miscelando i campioni proteici con il colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 (reagente Bradford) e misurando le loro assorbanze a 595 nm, che è nell’intervallo visibile. Quindi, è sufficiente uno spettrofotometro VIS, come quello illustrato nel ns. articolo che trovate qui.

Materiali e reazioni nel test delle proteine di Bradford; Fonte standard, fosfato
tampone e reagente (1), campione (Ag B) (2), preparazione del “blank”, standard e diluizioni del campione in provetta da 0,5 ml (3), la reazione del reagente del test e lo standard BSA (reagente del dosaggio (A), la miscela del reagente del test con lo standard BSA (B)) (4), la reazione colorante del “blank”, gli standard BSA e le diluizioni del campione.

Solo le molecole che si legano alle proteine ​​in soluzione tramite le interazioni elettrostatiche e con le interazioni di Van Der Waals presentano questo cambiamento di assorbimento, il che elimina la preoccupazione che le molecole non legate del colorante possano contribuire alla lettura dell’assorbimento ottenuta sperimentalmente. Questo processo è più vantaggioso poiché è meno costoso di altri metodi, facile da usare e ha un’alta sensibilità del colorante per le proteine.

Procedura per eseguire il test di Bradford

Il test proteico si basa sulla procedura di legame del colorante Bradford che misura il cambiamento di colore del colorante Coomassie in blu brillante quando si lega alle proteine. Il test, nella sua versione qualitativa, è molto semplice. Pipetta un campione di 20 μl della soluzione da analizzare in una provetta di reazione, quindi aggiungi 800 μl di acqua deionizzata e 200 μl di colorante blu brillante Coomassie. Mescola il tutto, lascia che si svolga la reazione per 5 minuti e osserva la reazione del colore.

In presenza di proteine, la soluzione diventerà quasi immediatamente – attraverso un processo che richiede circa 2 minuti – di colore blu (ciò può essere misurato quantitativamente con un fotometro a 595 nm). Come spettrofotometro, puoi usare lo strumento auto costruito illustrato nel nostro articolo Come costruire uno spettrofotometro, che puoi trovare qui. La soluzione per il test proteico contiene metanolo e acido fosforico e, pertanto, deve essere usata con cautela.

Schema di uno spettrofotometro autocostruibile.

Dopo 5 minuti di incubazione, l’assorbanza può essere letta a 595 nm usando lo spettrofotometro. Questo test è uno dei test più veloci eseguibili sulle proteine. Il tempo totale necessario per impostare e completare il test è inferiore a 30 minuti. L’intero esperimento viene eseguito a temperatura ambiente. Il test di Bradford delle proteine ​​può misurare una quantità di proteine ​​da 1 a 20 μg. Costituisce dunque una tecnica di laboratorio estremamente sensibile.

Sali, solventi, tamponi, conservanti, agenti riducenti e agenti chelanti metallici non interferiscono con il test. Il grafico lineare acquisito dal dosaggio (assorbanza rispetto alla concentrazione proteica in μg/mL) può essere facilmente estrapolato per determinare la concentrazione di proteine ​​usando la pendenza della linea. Il reagente colorante è un prodotto pronto all’uso stabile preparato in acido fosforico. Può rimanere a temperatura ambiente per un massimo di 2 settimane prima che inizi a degradarsi.

Il test di Bradford è lineare su un intervallo breve, in genere da 0 µg/mL a 2000 µg/mL, rendendo spesso necessarie le diluizioni di un campione prima dell’analisi. Nel fare queste diluizioni, l’errore in una diluizione viene aggravato in ulteriori diluizioni risultando in una relazione lineare che potrebbe non essere sempre accurata. La non linearità deriva dall’equilibrio tra due diverse forme di colorante che è perturbato dall’aggiunta della proteina. Il test di Bradford si linearizza misurando il rapporto delle assorbanze, 595 nm su 450 nm. Questo test modificato è circa 10 volte più sensibile di quello convenzionale.

Assorbanza alle varie lunghezze d’onda con il test di Bradford delle proteine. A sinistra il picco viola del solo colorante, a destra il picco grigio del campione cui è stato aggiunto il colorante. 

Come determinare la concentrazione proteica

Per svolgere un test di Bradford quantitativo anziché qualitativo, avrai bisogno di:

  • Gamma globulina di plasma bovino liofilizzato (BSA)
  • Coomassie Brilliant Blue 1
  • Soluzione NaCl 0,15 M
  • Spettrofotometro e cuvette
  • Micropipette

Per effettuare il test di Bradford, prepara una diluizione di 4 volte di un campione di BSA da 2 mg/mL aggiungendo 50 mcL di BSA da 2 mg/mL a 150 mcL di acqua dI per ottenere 200 mcL di 0,5 mg / mL di BSA. Genera i campioni di prova per la “reference cell”, un “blank” (cioè un campione con zero proteine), gli standard BSA e il campione proteico da testare secondo la Tabella in cuvette monouso.

Si noti che la “cella di riferimento” e il “blank” sono identici. Un campione di prova per la “reference cell” è necessario solo quando si utilizza uno spettrofotometro UV visibile a doppio raggio per le misurazioni dell’assorbanza. Si noti, inoltre, che potrebbe essere necessaria una diluizione del campione proteico affinché l’assorbanza risultante rientri nell’intervallo lineare del test.

Preparazione di campioni per il test delle proteine Bradford.

Lascia incubare ogni campione a temperatura ambiente per 10-30 minuti (registra il tempo di incubazione effettivo sul tuo notebook). Misura l’assorbanza di ciascun campione a 595 nm usando uno spettrofotometro UV-visibile. Accertati che lo strumento si riscaldi per almeno 15 minuti prima dell’uso. Traccia l’assorbanza di ogni BSA standard in funzione della sua concentrazione teorica.

L’andamento della curva dovrebbe essere lineare. Determina il miglior adattamento dei dati a una linea retta sotto forma dell’equazione “y = mx + b” dove y = assorbanza a 595 nm e x = concentrazione proteica. Utilizza questa equazione per calcolare la concentrazione del campione proteico in base all’assorbanza misurata. Se l’assorbanza del campione di prova è al di fuori dell’intervallo di assorbanza per gli standard, il test deve essere ripetuto con una diluizione più appropriata.

In sintesi, per trovare una curva standard, è necessario utilizzare concentrazioni variabili del campione proteico, per creare una curva standard con la concentrazione tracciata sull’asse x e l’assorbanza tracciata sull’asse y. Viene utilizzata solo una concentrazione proteica ristretta (2-10 μg/mL) al fine di creare una curva standard accurata. L’uso di un’ampia gamma di concentrazione proteica renderà più difficile determinare la concentrazione proteica sconosciuta.

Dati BSA effettivi ottenuti da uno spettrofotometro UV-Vis su micro scala.

Questa curva standard viene quindi utilizzata per determinare la concentrazione proteica sconosciuta. Quanto segue elabora come si passa dalla curva standard alla concentrazione dell’ignoto. Innanzitutto, aggiungi una linea di adattamento ottimale, o regressione lineare, e visualizza l’equazione sul grafico. Idealmente, il valore R2 sarà il più vicino possibile a 1. R rappresenta la somma dei valori quadrati dell’adattamento sottratto da ciascun punto dati. Pertanto, se R2 è molto inferiore a uno, considera di ripetere l’esperimento per ottenere dati più affidabili.

L’equazione visualizzata sul grafico fornisce un mezzo per calcolare l’assorbanza e quindi la concentrazione sconosciuta dei campioni. Nel grafico, x è la concentrazione e y è l’assorbanza, quindi è necessario riorganizzare l’equazione per risolvere per x ed inserire l’assorbanza dell’ignoto misurato. Per raggiungere una concentrazione sensata con i dati, le diluizioni, le concentrazioni e le unità dell’ignoto devono essere normalizzate dividendo la concentrazione per volume di proteina e moltiplicando per la quantità diluita per correggere l’eventuale diluizione della proteina prima di eseguire il test.

Dati effettivi del test per determinare la concentrazione di proteine nel campione sconosciuto sulla base della linea di migliore adattamento della curva standard sopra indicata.

Inoltre, si noti che i reagenti nel test di Bradford tendono a macchiare le provette. Le stesse provette, pertanto, non possono essere utilizzate poiché la colorazione influirebbe sulla lettura dell’assorbanza. Questo metodo è anche sensibile al tempo. Quando viene testata più di una soluzione, è importante assicurarsi che ogni campione venga incubato per lo stesso periodo di tempo per un confronto accurato.

Il colorante Coomassie Blue G250 usato per legarsi alle proteine ​​nel metodo originale Bradford si lega prontamente ai gruppi di proteine ​​arginina e lisina. Ciò è uno svantaggio perché la preferenza del colorante a legarsi a questi aminoacidi può provocare una risposta variata del test tra proteine ​​diverse. Sono state apportate modifiche al metodo originale, come aumentare il pH aggiungendo NaOH o aggiungendo più colorante per correggere questa variazione, ma in generale non è opportuno adottarle.

L’analisi dei campioni sconosciuti ha solitamente come riferimento standard quella dell’albumina sierica bovina (BSA).