Come misurare il potenziale d’azione dei neuroni

Il “potenziale d’azione” è la breve inversione (circa un millesimo di secondo) della polarizzazione elettrica della membrana di una cellula nervosa (neurone) o di una cellula muscolare. Nel neurone un potenziale d’azione produce l’impulso nervoso e nella cellula muscolare produce la contrazione richiesta per tutti i movimenti. L’onda di eccitazione viene attivamente trasmessa lungo il nervo o la fibra muscolare, a velocità che vanno da 1 a 100 metri al secondo, a seconda delle proprietà della fibra. In questo articolo vedremo come si può misurare il potenziale di azione dei neuroni in piccoli animali: gli insetti.

Il tuo cervello utilizza una combinazione di prodotti chimici ed elettricità per operare. Le cellule cerebrali (neuroni) comunicano tra loro per controllare il tuo corpo. Un cervello con solo 1 neurone non è un cervello. Un cervello è una rete di neuroni. Il tuo cervello ha e usa circa ottanta miliardi di neuroni! Ma come si parlano tutti questi neuroni? Uno dei primi modi in cui le cellule utilizzavano la rete era la comunicazione chimica. I batteri, ad esempio, usano questo metodo.

Funziona bene, ma è limitato dalla diffusione. Ad esempio, quando si rilascia un odore su un lato della stanza, quanto tempo impiega qualcuno sul bordo della stanza ad annusarlo? Dovrebbe esserci un modo più veloce. Ma c’è un altro problema. Il segnale deve viaggiare lungo la cellula. C’è un modo per renderlo più veloce? La risposta è: l’energia elettrica! Nota quanto velocemente le luci della tua casa si accendono quando premi l’interruttore. Per questo anche i neuroni usano l’elettricità.

I neuroni comunicano fra loro grazie a una combinazione di segnali elettrici e chimici.

La base del segnale elettrico che viaggia da un’area all’altra del sistema nervoso è la distribuzione controllata degli ioni attraverso la membrana cellulare. I canali ionici attraverso la membrana regolano quando gli ioni possono muoversi all’interno o all’esterno della cellula, in modo da generare un segnale preciso. Questo segnale è il “potenziale d’azione”, che ha una forma molto caratteristica basata sulle variazioni di tensione attraverso la membrana in un determinato periodo di tempo.

Gli impulsi elettrici viaggiano lungo i neuroni. Questo impulso si chiama “spike”, o picco. In questo articolo, imparerai a registrare i potenziali d’azione ed a vedere i relativi “picchi” caratteristici (vedi la figura qui sopra) in tempo reale. Questo è un ottimo punto di partenza per il tuo laboratorio di biologia e per lo studio sperimentale del sistema nervoso, ed è adatto anche per gli studenti della scuola media. Osserva i potenziali d’azione dal vivo in un’attività di laboratorio coinvolgente!

Il cosiddetto “potenziale d’azione”. Tracciando la tensione misurata attraverso la membrana cellulare nel tempo, il potenziale d’azione inizia con la depolarizzazione, seguita dalla ripolarizzazione, che passa dall’iperpolarizzazione al potenziale a riposo, e infine la membrana torna a riposare.

I segnali di neuroni e cellule muscolari: il potenziale d’azione

Un potenziale d’azione è un rapido aumento e conseguente calo di tensione o di potenziale di membrana attraverso una membrana cellulare, con un modello caratteristico. È necessaria una corrente sufficiente per avviare una risposta di tensione in una membrana cellulare; se la corrente non è sufficiente per depolarizzare la membrana al livello di soglia, il potenziale d’azione non si attiva. Esempi di cellule che segnalano attraverso potenziali d’azione sono i neuroni e le cellule muscolari.

Il premio Nobel per la fisiologia o la medicina fu assegnato nel 1963 a Sir A.L. Hodgkin, Sir A.F. Huxley e Sir John Eccles per aver formulato i meccanismi ionici coinvolti nell’attività delle cellule nervose. Ecco, in pratica, quello che succede, come illustrato dalla figura qui sotto:

  1. Lo stimolo avvia il rapido cambiamento di tensione o potenziale d’azione. In modalità patch-clamp è necessario somministrare alla cella una corrente sufficiente per aumentare la tensione al di sopra della tensione di soglia per avviare la depolarizzazione della membrana.
  2. La depolarizzazione è causata da un rapido aumento del potenziale della membrana che apre i canali del sodio nella membrana cellulare, con conseguente forte afflusso di ioni sodio.
  3. La ripolarizzazione della membrana deriva da una rapida inattivazione dei canali del sodio e da un grande efflusso di ioni di potassio risultanti da canali di potassio attivati.
  4. L’iperpolarizzazione è un potenziale di membrana ridotto causato dall’efflusso di ioni di potassio e dalla chiusura dei canali di potassio.
  5. Lo stato di riposo è quando il potenziale di membrana ritorna alla tensione di riposo verificatasi prima dello stimolo.

Schema essenziale degli stadi del potenziale di azione.

Prima della stimolazione, dunque, un neurone o una cellula muscolare ha una polarizzazione elettrica leggermente negativa; cioè, il suo interno ha una carica negativa rispetto al fluido extracellulare. Questo stato polarizzato è creato da un’alta concentrazione di ioni sodio caricati positivamente all’esterno della cellula e da un’alta concentrazione di ioni cloruro caricati negativamente (nonché da una concentrazione inferiore di potassio caricato positivamente) all’interno.

Il potenziale a riposo risultante, di solito, misura circa -75 millivolt (mV) o -0,075 volt, il segno meno indica una carica negativa all’interno. La stimolazione della cellula da parte dei neurotrasmettitori o delle cellule del recettore sensoriale apre parzialmente le molecole proteiche a forma di canale nella membrana. Ciò inizia con un’apertura di canale per Na+ nella membrana. Il sodio si diffonde nella cellula, spostando quella parte della membrana verso una polarizzazione meno negativa.

Con un elettrodo posizionato all’interno di un neurone e l’altro all’esterno, il voltmetro “misura” la differenza nella distribuzione degli ioni all’interno rispetto all’esterno. E, in questo esempio, il voltmetro legge -70 mV (mV = millivolt). In altre parole, l’interno del neurone è leggermente negativo rispetto all’esterno. Questa differenza viene definita potenziale di membrana a riposo.

Se questo potenziale locale raggiunge uno stato critico chiamato “potenziale di soglia” (che misura circa -55 mV), i canali del sodio si aprono completamente. Qualsiasi depolarizzazione che non modifica il potenziale di membrana a -55 mV o superiore non raggiungerà la soglia e quindi non determinerà un potenziale d’azione. Inoltre, qualsiasi stimolo che depolarizza la membrana a -55 mV o oltre provocherà l’apertura di un gran numero di canali e verrà avviato un potenziale d’azione.

Poiché la concentrazione di Na+ è maggiore all’esterno della cellula che all’interno della cellula di un fattore 10, gli ioni si precipiteranno nella cellula, guidati in gran parte dal gradiente di concentrazione. Poiché il sodio è uno ione carico positivamente, cambierà la tensione relativa all’interno della cella rispetto a quella esterna. Il sodio inonda quella parte della cellula, che si depolarizza all’istante a un potenziale d’azione di circa +30 mV, in cui K+ provoca la ripolarizzazione.

Fasi di un potenziale d’azione. Tracciando la tensione misurata attraverso la membrana cellulare nel tempo, gli eventi del potenziale d’azione possono essere correlati a variazioni specifiche della tensione della membrana. (1) A riposo, la tensione della membrana è di -70 mV. (2) La membrana inizia a depolarizzare quando viene applicato uno stimolo esterno. (3) La tensione della membrana inizia un rapido aumento verso +30 mV. (4) La tensione della membrana inizia a tornare a un valore negativo. (5) La ripolarizzazione continua oltre la tensione di membrana a riposo, con conseguente iperpolarizzazione. (6) La tensione di membrana ritorna al valore di riposo poco dopo l’iperpolarizzazione.

Uno stimolo più forte, che potrebbe depolarizzare la membrana ben oltre la soglia, non produrrà un potenziale d’azione “più grande”. La depolarizzazione attiva i canali del sodio nelle parti adiacenti della membrana, così che l’impulso si muova lungo la fibra. Naturalmente, se l’ingresso di sodio nella fibra non fosse bilanciato dall’uscita di un altro ione di carica positiva, un potenziale d’azione non potrebbe declinare dal suo valore di picco e ritornare al potenziale di riposo.

La fase in declino del potenziale d’azione è causata dalla chiusura dei canali del sodio e dall’apertura dei canali del potassio, che consente a una carica approssimativamente uguale a quella introdotta nella cellula di uscire sotto forma di ioni di potassio. Successivamente, le molecole di trasporto delle proteine pompano gli ioni sodio dalla cellula e gli ioni potassio. Ciò ripristina, al termine, le concentrazioni ioniche originali e prepara la cellula a un nuovo potenziale d’azione.

I potenziali d’azione possono essere registrati e misurati facilmente con un oscilloscopio digitale USB Instrustar, che dispone della funzione di registrazione. Lo trovi ad es. qui.

Tutto ciò avviene in circa 2 millisecondi. Mentre è in corso un potenziale d’azione, non è possibile avviarne un altro. Tale effetto è indicato come “periodo refrattario”. Esistono, in particolare, due fasi del periodo refrattario: il periodo refrattario assoluto e il periodo refrattario relativo. Durante la fase assoluta, non si avvierà un altro potenziale d’azione. Una volta che il canale Na+ è tornato alla sua conformazione a riposo (inferiore a -55 mV), un nuovo potenziale d’azione potrebbe essere avviato, ma solo da uno stimolo più forte di quello che ha avviato l’attuale potenziale d’azione.

Come misurare il potenziale d’azione di un neurone

Per misurare il potenziale d’azione nei neuroni, possiamo usare piccoli animali o insetti, ad es. gli scarafaggi. Come la maggior parte degli animali multicellulari (oltre alle creature come le spugne marine), i corpi degli scarafaggi sono pieni di nervi (che sono fasci di neuroni) per controllare il movimento e la sensazione. Come detto in precedenza, i neuroni usano una combinazione di segnalazione elettrica e chimica per funzionare. Abbiamo appena illustrato come un neurone genera l’impulso elettrico.

Gli insetti si prestano particolarmente allo studio dei potenziali d’azione.

Esso è dovuto a una differenza sia chimica che elettrica all’interno e all’esterno della membrana neurale. Il movimento di sodio e potassio attraverso la membrana neurale provoca la variazione momentanea della tensione chiamata potenziale d’azione o “picco” (spike). Quando il picco raggiunge la fine dell’assone, causa il rilascio di neurotrasmettitore attraverso la sinapsi, il che può cambiare le proprietà elettriche del neurone successivo, rendendo più o meno probabile l’attivazione di un picco proprio.

Cercheremo di misurare i picchi, usando una gamba di scarafaggio (non preoccuparti, la gamba di scarafaggio può ricrescere). Sullo scarafaggio, ogni spina su ogni gamba è innervata da un neurone. Toccando le spine, i neuroni fanno scattare gli “spike”. Con più forza applicata alla spina, si verificano ancora più picchi. Questa relazione tra picchi e forza dello stimolo è chiamata “codifica della frequenza” ed è stata scoperta, nel 1926, sui muscoli delle rane da Lord Edgar Adrian, in Inghilterra.

Questa “codifica della frequenza” semplicemente misura il numero di questi picchi che si verificano durante un determinato periodo di tempo. Anche se è semplice, tuttavia la codifica dei tassi può essere utilizzata per rispondere a domande complesse su come i neuroni rispondono agli stimoli.

Ora rifaremo questa scoperta e faremo l’esperimento relativo. Ecco la procedura da seguire:

  1. Prendi uno scarafaggio e mettilo in un barattolo di acqua ghiacciata. Attendi qualche minuto fino a quando si ferma.
  2. Rimuovi lo scarafaggio dall’acqua ghiacciata e, con uno strattone sul femore, togli una delle sue gambe. Non ti preoccupare, la gamba è progettata per rompersi facilmente in questa articolazione (come la coda di una lucertola) e tornerà a grandezza naturale entro 125 giorni. Tirare la gamba anziché tagliarla fa sì che lo scarafaggio rigeneri la gamba più velocemente.
  3. Riporta lo scarafaggio a casa sua. Andrà bene, la gamba ricresce se lo scarafaggio non è ancora un adulto (gli adulti hanno le ali, le ninfe no).
  4. Posiziona la gamba sul tuo tavolo di lavoro e infila due spilli nei punti mostrati in figura.

Collocazione degli elettrodi per la misurazione del potenziale d’azione.

  1. Ora tocca le spine sulla gamba con una sonda di plastica o con uno stecchino. Se senti un suono di popcorn in risposta alla manipolazione della spina, congratulazioni, hai appena sentito il picco dei tuoi primi neuroni!
  2. Ora vediamo come appare la scarica elettrica. Puoi usare un oscilloscopio digitale con possibilità di registrazione dei dati, come ad esempio un Instrustar (lo puoi trovare qui), che costa meno di 100 euro e comprende perfino un analizzatore di spettro. Collega il polo positivo e il polo negativo della sonda del canale 1 dell’oscilloscopio agli elettrodi, cioè uno a uno spillo e uno all’altro. Poni l’oscilloscopio in modalità registrazione, una delle opzioni di cui il software di Instrustar è dotato.
  3. Tocca di  nuovo le spine sulla gamba e vedrai qualcosa del genere (vedi figura sotto).
  4. Ingrandisci a posteriori la modalità di visualizzazione della soglia e vedrai un singolo picco in tutto il suo splendore.

Come effettuare uno studio più quantitativo

Grazie all’oscilloscopio digitale (un Intrustar ha un ADC a 8 bit e una risoluzione di 10 mV), puoi misurare la tensione del picco e la durata temporale dell’impulso. In alternativa all’oscilloscopio digitale, puoi creare un rivelatore di spike con Arduino (l’ADC di Arduino è a 10 bit, e ha una risoluzione di 5 mV), graficando il potenziale misurato come per le tensioni AC (vedi il nostro articolo che trovi qui). Esistono sul mercato anche dei kit per effettuare queste misurazioni, ma hanno un prezzo elevato, per cui le soluzioni fai-da-te qui proposte sono, per lo scienziato dilettante, più ragionevoli.

Per effettuare uno studio più quantitativo, prova a toccare diverse spine della gamba. Dovresti notare che toccare alcune spine provoca una risposta più robusta rispetto ad altre: in particolare, spostare le spine vicino all’articolazione tibia-tarso causa un’attività di spiking molto più robusta di quella causata dalla manipolazione delle spine vicino all’articolazione femore-tibia.

Un kit popolare sul web per acquisire il potenziale d’azione che costa circa 200 euro. In questo caso vi sono 3 spilli per poter acquisire due segnali su altrettanti canali, in modo da poter studiare la velocità del potenziale di azione. Un oscilloscopio digitale USB a due canali permette di fare altrettanto.

Ecco come puoi procedere per quantificare quanto appena esposto:

  1. Premi il pulsante “Registra” nell’opzione del software di Intrustar. Tocca una spina altamente reattiva per un secondo, rilascia, aspetta due secondi, quindi tocca di nuovo la linguetta. Fallo in modo da avere un totale di 10 “tocchi”.
  2. Ora inizia a toccare una spina meno reattiva con la stessa procedura (1 secondo acceso, 2 secondi spento, ripeti per un totale di 10 volte e interrompi la registrazione.
  3. Ora dovrai analizzare la registrazione. Misura la frequenza di spike in segmenti di 1 secondo, in cui misuri lo spike prima di toccare la punta e mentre la tocchi, in condizioni sia di bassa che alta risposta.
  4. A questo punto, puoi calcolare i tassi di spike medi per quando hai toccato le spine più reattive e meno reattive, e puoi confrontare il risultato con i tassi spontanei.

Possiamo anche fare un esperimento più controllato per vedere come diverse intensità della stimolazione influenzano la gamba dello scarafaggio. Puoi usare l’aria compressa fornita dal laboratorio nella tua scuola per stimolare la gamba di scarafaggio per questo esperimento. Se non hai aria compressa in laboratorio, a casa, in classe, nel cortile o ovunque tu scelga di studiare le neuroscienze, ci sono ancora molti modi per fare questo esperimento. Eccone alcuni che hanno funzionato.

Usa una cannuccia e soffia sulla gamba dello scarafaggio da diverse altezze. Puoi unire le cannucce a diverse altezze a un righello, per standardizzare le altezze. Assicurati di soffiare in misura costante durante ogni prova. È possibile acquistare aria compressa in una bomboletta spray in un negozio di articoli per ufficio, perché viene utilizzata per pulire tastiere e componenti del computer. Come con il metodo della cannuccia, puoi tenere la bomboletta di aria compressa a diverse altezze per ottenere diverse intensità di stimolazione (potresti provare a usare un metro e misurare a diverse distanze).

Un microscopio digitale USB è uno strumento a basso costo che ti sarà utilissimo per i tuoi esperimenti di elettrofisiologia sugli insetti. Ne trovi vari ad es. qui.

Ecco, in pratica, come procedere alle misurazioni:

  1. Inizia una registrazione e attendi 10 secondi.
  2. Ora stimola la gamba attivando l’aria compressa alla pressione più bassa (5 psi). Usa il tubo per dirigere l’aria compressa sulla gamba dello scarafaggio. Stimolarlo per almeno 5 secondi.
  3. Aumenta la pressione dell’aria a 10 psi e ripeti.
  4. Aumenta la pressione dell’aria a 15 psi e ripeti di nuovo.
  5. Aumenta la pressione dell’aria a 20 psi e ripeti di nuovo.
  6. Ripeti l’operazione per alcuni ulteriori aumenti della pressione dell’aria, interrompi la registrazione ed eseguire l’analisi della frequenza di spike come fatto in precedenza. Ovviamente, dovrai far passare 10 secondi fra un aumento e l’altro per poter riconoscere gli aumenti sulla registrazione.

Cosa hai trovato? Pensa ai tuoi risultati. Qualcosa sull’esperimento ti ha sorpreso? In tal caso, puoi spiegare perché? Pensa a tutti i modi in cui il tuo corpo utilizza la codifica della frequenza, ad esempio, pensa alla differenza tra un colpo superficiale e duro nel braccio! Nota: puoi anche fare questo esperimento sui grilli, se non hai accesso agli scarafaggi. Di solito è possibile acquistarli nei negozi di animali locali. Inoltre potresti provare anche a vedere cosa si osserva con vermi, lumache, insetti vari.

I neuroni motori, infatti, innervano la maggior parte dei muscoli degli insetti, e tipicamente vi è un assone veloce che produce una risposta rapida di contrazione nel muscolo e un assone lento che produce una risposta più lenta ma più sostenuta. L’assone veloce innerva ogni fibra in un muscolo, mentre l’assone lento innerva solo circa il 30-40% delle fibre. A seconda del grado di azione richiesto del muscolo, si attiva l’assone lento o rapido. Ciascun nervo motorio si collega alle fibre del muscolo.

Il sistema nervoso degli insetti. I neuroni motori portano gli impulsi motori dal sistema nervoso centrale agli attuatori specifici. I neuroni sensori, invece, portano gli impulsi sensoriali dagli organi sensoriali al sistema nervoso centrale.

La maggior parte dei muscoli scheletrici degli insetti sono muscoli sincroni che richiedono un input nervoso per ogni contrazione, ma i muscoli delle ali in alcuni insetti sono asincroni, e si possono ottenere contrazioni multiple per ciascun input del nervo motorio. L’abilità dei muscoli fibrillari di rilasciare contrazioni multiple è basata sull’arrangiamento anatomico nel torace, sull’anatomia interna e sulla fisiologia. Infine, tutti i muscoli degli insetti sono striati, compresi quelli viscerali.

Nel sistema nervoso dei lombrichi di terra, tre neuroni giganti hanno assoni che si sviluppano lungo l’asse dell’animale. Ciò permette di condurre un esperimento sulla velocità di propagazione del potenziale d’azione, ponendo gli elettrodi 1 e 2 a 40 mm di distanza fra loro sulla superficie del corpo del verme per registrare il potenziale d’azione del neurone gigante mediano, e un terzo elettrodo “di terra” come sorgente di riferimento per i due elettrodi di registrazione.

Quando la coda del lombrico viene toccata, un potenziale d’azione viaggia dal cervello dell’animale posto nella testa. Questo potenziale attraversa prima l’elettrodo 1 e poi, con un ritardo di pochi millisecondi, viene registrato anche dall’elettrodo 2. Conoscendo la distanza fra i due elettrodi (40 mm), e determinando la differenza nel tempo di arrivo dell’impulso elettrico sui due elettrodi, possiamo determinare la velocità di conduzione del potenziale d’azione (in m/s).

Lo studio della velocità del potenziale d’azione effettuato, in questo caso su un verme, con un sistema a 3 elettrodi e 2 canali.

Considera quindi i modi in cui potresti espandere i tuoi esperimenti, eventualmente adottando altre tecniche, come quelle descritte nel ns. articolo Come fare esperimenti di elettrofisiologia, che trovi qui. Forse potresti confrontare più zampe di scarafaggio e trovare alcuni standard medi, confrontare una gamba di scarafaggio con una gamba di cavalletta, sperimentare il posizionamento degli elettrodi o introdurre trattamenti chimici per le gambe di scarafaggio. Il mondo è tuo, ora esci e sperimenta!