Come misurare l’attività elettrica di piante ferite

Diversi articoli di rassegna sulla segnalazione elettrica delle piante scritti negli anni ’70 hanno indicato che tutte le piante superiori possono usare segnali elettrici per regolare varie funzioni fisiologiche. I tipi più comunemente descritti di cambiamenti di potenziale sono i cosiddetti potenziali d’azione (AP) e le cosiddette variazioni di potenziale (VP). Li vedremo quindi un po’ in dettaglio. In questo articolo vedremo poi come fare esperimenti per misurare i segnali elettrici prodotti a distanza dal “ferimento” di una foglia, ad esempio, con forbici, con insetti che mangiano le foglie o con l’aggressione di una fiamma. 

I potenziali d’azione (AP) sono depolarizzazioni propagate rapidamente del potenziale di membrana, indotte in modo “tutto o niente” e che viaggiano con ampiezza costante sulla distanza. In molti casi mostrano un periodo refrattario, nel senso che durante un certo intervallo dopo il passaggio di un potenziale d’azione, non può esserne generato uno nuovo in una determinata posizione. Vedi il nostro articolo Come misurare il potenziale d’azione delle piante, che trovi qui.

Le variazioni di potenziale (VP) – o potenziali di onde lente – sono costituiti invece da una depolarizzazione transitoria seguita da una ripolarizzazione lunga e ritardata. Rispetto agli AP, mostrano una ripolarizzazione più lunga e mostrano un ampio grado di variazione. Queste variazioni di potenziale possono essere indotte facilmente attraverso ferite, escissione di organi oppure fiamme.

Differenza tipica fra un potenziale di azione (AP) e una variazione di potenziale (VP).

La loro ampiezza, inoltre, dipende dall’intensità dello stimolo e le VP non si auto-perpetuano. L’ampiezza e la velocità di una VP diminuiscono quindi con l’aumentare della distanza dal sito della lesione. Mentre la segnalazione a lunga distanza da parte degli AP avviene principalmente nel “floema”, la VP è in grado di farlo passare attraverso lo “xilema” morto (floema e xilema sono illustrati più avanti).

Si pensa che le VP siano causate da un arresto temporaneo di una H+-ATPase nella membrana plasmatica (l’H+-ATPase è un enzima che serve per catalizzare il movimento transmembrana delle sostanze). Oltre ai potenziali di azione (AP) e alle variazioni di potenziale (VP), è stato descritto un ulteriore tipo di cambiamento di potenziale, noto come “potenziale di sistema”.

Questi ultimi segnali sono indotti da ferite e coinvolgono una iperpolarizzazione della membrana plasmatica che si auto-propaga e dura diversi minuti. Gli studi svolti suggeriscono che i potenziali di sistema siano dovuti all’attivazione della membrana plasmatica H+-ATPasi. Per misurare i potenziali elettrici nelle piante, vengono usate quindi registrazioni intracellulari oppure extracellulari.

Tipici potenziali d’azione e potenziali di variazione misurati nel girasole. La pianta schematizzata a sinistra (A) è stata stimolata elettricamente (5 V per 1 s) in un punto a circa 5 cm al di sotto del picciolo più basso (+/−) o ferita a caldo con una leggera fiamma applicata sulla punta di una foglia (W). Elettrodi di misurazione (fili d’argento inseriti) sono stati posizionati lungo lo stelo e un elettrodo di riferimento è stato inserito nel vaso. Le risposte elettriche allo stimolo elettrico sono potenziali d’azione mostrate al centro (B). Le risposte elettriche allo stimolo termosaldante sono invece potenziali di variazione che sono mostrati a destra (C). Nota: la stimolazione elettrica ha evocato un AP puro, mentre la ferita a fiamma ha evocato un AP / VP combinato, con il primo che “viaggia” più velocemente del secondo.

Come è fatta una pianta: le parti da conoscere

Le piante sono costituite da tre parti fondamentali: radici, fusto e foglie, che possono essere pensati come degli organi, cui sia aggiungono quelli riproduttivi, ovvero fiore e frutto. La radice è l’organo deputato all’assorbimento dell’acqua e dei sali in essa contenuti. Il fusto, attraverso i canali vascolari, costituisce il tramite fra le strutture assorbenti (le radici) e quelle produttrici.

La foglia è la parte della pianta dedita alla cattura dell’energia solare, ed al suo stoccaggio tramite il ben noto processo della fotosintesi clorofilliana, oltre che alla traspirazione, che permette alla pianta di eliminare il vapore acqueo. La superficie della foglia è attraversata da diverse nervature, che contengono i vasi che trasportano le sostanze coinvolte nella fotosintesi.

Le parti principali di una pianta.

Il fusto può andare incontro a due fasi di accrescimento: quello primario, di allungamento, e quello secondario, di ispessimento. I fusti dotati del solo accrescimento primario vengono chiamati “fusti erbacei”, e sono caratterizzati da un’elevata flessibilità, mentre i fusti nei quali si sviluppa anche una struttura secondaria si chiamano “fusti legnosi” (basta pensare agli alberi).

Il legno più vecchio, o xilema primario, si trova spostato verso il centro del fusto, mentre i nuovi fasci legnosi – che costituiscono lo xilema secondario – vengono spinti verso la corteccia. La zona di reale trasporto dei liquidi nel tronco è dunque limitata a un anello posto fra la zona corticale e la parte più interna del fusto. Nelle piante grasse, però, il parenchima acquifero è molto sviluppato.

I tessuti conduttori sono formati da diversi tipi cellulari, pertanto sono distinguibili due tessuti che svolgono due trasporti fondamentali per la pianta, quello dell’acqua e dei sali in essa disciolti, e quello delle sostanze nutrienti: si tratta del floema e dello xilema. Ciò che trasportano viene chiamato, rispettivamente, linfa grezza (nel caso dello xilema) e linfa elaborata (nel caso del floema).

Floema e xilema di una pianta.

Le cellule che formano lo xilema (o “legno”) sono cellule morte che non hanno protoplasma. Presentano delle pareti ispessite e lignificate e proprio questo processo di lignificazione, a maturazione, porta alla lisi delle cellule che disposte in modo ordinato vanno a costituire dei veri e propri canali. Questi vasi permettono il trasporto di acqua e soluti lungo la pianta, dal basso verso l’alto.

Il floema (tessuto cribroso) trasporta la linfa elaborata – ovvero quell’insieme di sostanze organiche (tra cui gli zuccheri provenienti dalla fotosintesi e gli ormoni) – in direzione opposta a quello dello xilema, ovvero dalle foglie al resto della pianta. Le cellule che costituiscono il floema, a differenza di quelle xilematiche, sono vive e le pareti di queste, seppur ispessite, non risultano mai lignificate.

Come fare registrazioni extracellulari ed intracellulari

Le registrazioni extracellulari sono ampiamente utilizzate nell’elettrofisiologia animale e anche umana. Misurano la somma dell’attività elettrica di un gran numero di cellule. Esempi di tali misure molto utilizzate nella pratica medica sono gli elettroencefalogrammi (EEG) e gli elettrocardiogrammi (ECG). Un altro esempio è l’elettromiografia, illustrata in un nostro articolo propedeutico che trovi qui.

Un esempio di tracciato elettromiografico associato alle varie dita di una mano. Si tratta di un esempio di misurazione extracellulare, infatti la forma d’onda non è ben definita essendo la somma di tante forme d’onda dovute a singole cellule.

Per molti anni, le registrazioni extracellulari sono state l’unica tecnica di registrazione elettrofisiologica disponibile per misurare i potenziali nelle piante. Nelle piante superiori, possono essere eseguite due varianti di registrazioni extracellulari, in perfetta analogia con quanto accade per gli animali e per l’uomo: 1) misurazioni utilizzando elettrodi metallici inseriti o 2) registrazioni di superficie.

Per poter misurare i potenziali extracellulari deve esserci un circuito completo, quindi è necessario un elettrodo aggiuntivo. Questo può essere un elettrodo di terra inserito nel terreno (la cosa più semplice) o un elettrodo di riferimento in qualche altra parte della pianta. Misurazioni usando elettrodi inseriti (extracellulari) possono essere, ad esempio, realizzate con varie specie di alberi.

I cambiamenti di potenziale superficiali sono stati associati all’espressione genica di risposta alla ferita. Anche l’inserimento di elettrodi provoca, inevitabilmente, reazioni alla ferita. Al contrario, le registrazioni di superficie non sono invasive. Gli elettrodi per le registrazioni di superficie sono generalmente fili di Ag/AgCl a contatto con una soluzione di cloruro di potassio (KCl), reso viscoso con dell’agar.

Un elettrodo utilizzabile con una soluzione ad hoc come quella citata nel testo.

Voi potete effettuare lo studio della segnalazione elettrica indotta da ferita (per verificare se quella a lunga distanza è elettrica) ad es. nell’Arabidopsis, misurando il potenziale di superficie. La ferita alla foglia può venire fatta usando insetti (un bruco) o manualmente con una pinza o forbice. Inoltre, si può misurare il potenziale di superficie su foglie diverse per studiare la segnalazione foglia-foglia.

I metodi elettrofisiologici utilizzati nello studio sull’Arabidopsis sono, tuttavia, ampiamente applicabili a altre piante, compresi i monocotiledoni. Inoltre, il metodo di registrazione del potenziale superficiale può ovviamente essere applicato ad altri stimoli e per indagare altre risposte fisiologiche. Al contrario, lo studio del potenziale di azione della singola cellula richiede l’uso di elettrodi intracellulari.

Lo studio del potenziale di azione nella mimosa pudica.

I cambiamenti misurati nel potenziale di superficie sono indirettamente correlati agli eventi di segnalazione elettrica che si verificano nelle strutture interne della foglia. Questo approccio, tuttavia, non fornisce un valore assoluto dei potenziali di membrana. Il potenziale di membrana di una cellula può essere misurato mediante registrazioni intracellulari, proprio come nel caso animale.

A tal fine, microelettrodi di vetro con una punta fine (<1 µm di diametro) riempito con una soluzione di KCl a contatto con un filo Ag / AgCl vengono inseriti nel citoplasma o nel vacuolo della cellula. Un secondo elettrodo, l’elettrodo di riferimento, è collocato nel bagno che circonda la cellula o la foglia contenente la cellula e la differenza di potenziale tra i due elettrodi viene misurata, dando un valore assoluto della differenza di potenziale transmembrana (vedi qui per l’analogo su cellule animali).

Un ricercatore prepara un elettrodo per misurazioni intracellulari.

Queste misurazioni intracellulari sono invasive e sono normalmente possibili solo in brevi periodi di tempo (al massimo 1-2 h). Sebbene le registrazioni del potenziale di superficie siano solo misurazioni indirette di segnalazione elettrica, hanno il vantaggio rispetto alle registrazioni intracellulari di essere relativamente facili da imparare e rapide – che è un vantaggio per lo screening delle piante mutanti – e non invasivo, che è ovviamente importante per lo studio della segnalazione delle ferite.

L’attività elettrica dipende dal trasporto di ioni e le concentrazioni di ioni locali possono essere misurate con microelettrodi ione-specifici, fornendo informazioni sui movimenti di ioni sottostanti i segnali elettrici. Poiché i cambiamenti nelle concentrazioni citoplasmatiche di Ca2+ possono contribuire alla segnalazione, i metodi di monitoraggio intracellulare di tali concentrazioni hanno contribuito alla comprensione dei meccanismi della segnalazione della ferita nelle piante.

Come misurare la segnalazione elettrica delle ferite

Per misurare la segnalazione elettrica delle ferite, occorre mantenere le piante rigorosamente prive di parassiti. Garantire condizioni di crescita ottimali è molto importante, invece, per la segnalazione foglia-foglia. Possiamo usare delle Arabidopsis di 5 settimane coltivate nel terreno, con una pianta per vaso di 7 cm di diametro, coltivata in luce a 22 ° C, 70% di umidità per 10 ore e buio a 18 °C, 70% di umidità per 14 ore, ed innaffiata delicatamente. La pianta non dovrebbe iniziare a produrre un fiore.

Una pianta di Arabidopsis. Naturalmente, puoi usare anche altre piante per i tuoi esperimenti.

Le piante vengono poste in una gabbia di Faraday (che scherma le interferenze elettriche esterne) per almeno 10 minuti prima della “immobilizzazione” delle foglie, procedura di cui parleremo fra poco. Si noti che molti amplificatori producono meno rumore elettrico se vengono posizionati all’interno della gabbia di Faraday. Gli esperimenti vengono condotti in una stanza climatizzata, ad esempio intorno a 22 °C. La luce è fornita da una lampada di crescita posizionata dietro o accanto alla gabbia di Faraday.

Se la foglia deve essere ferita con una pinza, va correttamente immobilizzata con l’aiuto di una pentola per ridurre al minimo gli artefatti indotti dalla ferita. Ciò viene fatto 5 minuti prima della registrazione. In molti esperimenti, verranno ferite le foglie più grandi (queste foglie sono facilmente accessibili alle pinze). Taglia un supporto della forma di un semicerchio di plastica morbida (ad es. da cartelle di documenti in plastica) e posizionalo con cura sotto le foglie e attaccalo sulla pentola con del nastro adesivo (v. figura).

Come fissare una foglia e gli elettrodi sulla pentola prima della “ferita” con le forbici.

Posiziona un pezzo di plastica più piccolo, rettangolare, sopra la foglia e fissalo al supporto di plastica a semicerchio. Dopodiché poni i due elettrodi nei punti mostrati in figura, mentre l’elettrodo di riferimento va inserito nel terreno del vaso. A questo punti puoi ferire la foglia con delle forbici. Ogni pianta viene utilizzata una sola volta per la stimolazione della ferita. Occorre infatti un’analisi del periodo refrattario per determinare il tempo richiesto dal sistema per il completo recupero.

Per ferire, premi brevemente la foglia tra le due lame in modo tale che i tagli siano paralleli all’asse lungo la foglia. Infliggi la prima ferita alla punta della foglia, la seconda adiacente ad essa, e così via, fino a quando il 40-50% della foglia è stato ferito. La procedura di ferita deve essere completata entro circa 10 s. Puoi “ferire” anche con gli insetti. Usa ad es. le larve di Spodoptera littoralis. Gli insetti vengono allevati su cavolo e affamati per 2 ore prima dell’applicazione alle piante Arabidopsis.

Esempio di insetto che puoi usare per “ferire” la foglia.

Come realizzare l’attrezzatura necessaria per l’esperienza

L’attrezzatura elettronica richiesta per questi esperimenti è la seguente:

  • Amplificatore di strumentazione (per procurartelo con pochi euro, leggi il nostro articolo che trovi qui), tenendo presente che per la registrazione su 4 posizioni sono richiesti due di questi amplificatori a doppio canale (ma per i primi esperimenti di amplificatori ne basta uno);
  • Interfaccia e software di acquisizione dati (ad es. Arduino e relativo software di visualizzazione Meguno Link Pro, o altro sistema di conversione analogico-digitale);
  • Cavi schermati con connettori BNC;
  • Filo d’argento del diametro di 0,5 mm per elettrodi Ag/AgCl;
  • Lampada alogena 230 V, 400 W (opzionale).

Per realizzare gli elettrodi di registrazione Ag/AgCl taglia un pezzo di filo d’argento lungo 4 cm, piega un’estremità di 180° per ottenere un semicerchio con un diametro di circa 1 mm (v. figura). Salda l’altra estremità a un adattatore a jack da 2 mm jack. Clorizza l’estremità curva del filo su 1-2 cm, per ricoprire con uno strato di AgCl. Dopo alcuni usi, i fili devono essere riclorati. Per la clorurazione, collega il catodo di una batteria da 1,5 V su un filo normale e inserisci la sua estremità in una soluzione HCl 0,1 M.

Schema di un grosso elettrodo Ag/AgCl commerciale.

A questo punto, collega l’elettrodo Ag / AgCl all’anodo di questa batteria e immergi la sua estremità curva a 1-2 cm di profondità nella soluzione per alcune decine di secondi. Gli atomi di Ag nel filo d’argento rinunciano ai loro elettroni e si combinano con ioni in soluzione producendo l’insolubile l’AgCl, visibile come un rivestimento scuro. Ora manca solo l’elettrodo di massa, o di terra che dir si voglia.

Prepara un elettrodo Ag / AgCl dritto di 3 cm di lunghezza, saldalo a un filo che sia collegato alla terra dell’amplificatore e cloridizza l’elettrodo come descritto sopra. Taglia l’ultimo millimetro dell’estremità fine di una punta di pipetta, riempila con la soluzione KCl / agar e posiziona l’elettrodo Ag / AgCl nella punta. Questo elettrodo di terra verrà quindi bloccato nel terreno della pianta che registri. Dopo alcune ore di registrazione, sostituisci la soluzione KCl nell’elettrodo di terra.

La soluzione di cloruro di potassio 10 mM / agar 0,5% (p/v) va sciolta sotto riscaldamento e si raffredda delicatamente con agitazione (agitatore magnetico) per preparare una soluzione viscosa omogenea. La soluzione va conservata a temperatura ambiente e può essere utilizzata per un massimo di due mesi. Infine, utilizza cavi BNC per collegare l’uscita del segnale degli amplificatori di strumentazione alle prese di ingresso dell’interfaccia analogico/digitale (1 cavo per canale).

Utilizza sempre cavi BNC, o comunque schermati, per collegare l’amplificatore di strumentazione all’ADC. Ciò è molto importante quando si lavora sui biosegnali.

Per ridurre al minimo il prelievo elettrico radiativo (principalmente rumore di frequenza dalla luce e dalle prese di corrente), la configurazione di misurazione è collocata in una gabbia di Faraday e tutte le parti metalliche (gabbia, piastra di terra, micromanipolatori) sono collegati alla massa del segnale dell’amplificatore. Per evitare anelli di massa, collega tutti i cavi utilizzati per la messa a terra in un unico punto, a sua volta collegato in un solo posto alla terra fornita da una presa a muro.

Come procedere alla registrazione dei segnali

Per registrare segnali privi di segnali veloci (cioè, in pratica, se non dobbiamo misurare i potenziali di azione, e nei nostri esperimenti di questo articolo non è il nostro obiettivo) vengono generalmente utilizzate frequenze di campionamento di 40-100 Hz (corrispondenti a 40-100 campionamenti per secondo). Se la frequenza di campionamento è troppo bassa, le variazioni di tensione potrebbero non essere ben risolte o possono risultare distorte a causa del fenomeno dell‘aliasing.

L’aliasing, o distorsione da campionamento lento o da sottocampionamento, nell’elaborazione numerica dei segnali è il fenomeno per il quale due segnali analogici diversi possono diventare indistinguibili una volta campionati.

Per gli esperimenti iniziali suggeriamo quindi di usare una frequenza di campionamento relativamente alta, ad es. 1-10 kHz (corrispondenti a a 0,1-1 ms di distanza temporale fra un campionamento e l’altro, cosa facilmente impostabile ad es. in uno sketch di Arduino). Una volta conosciuta la velocità dei segnali osservati, la frequenza di campionamento può essere ridotta in esperimenti dello stesso tipo a una che consente ancora la risoluzione degli eventi osservati, ma crea file più piccoli.

La registrazione dei cambiamenti del potenziale di superficie per ciascuna pianta stimolata ferendola con una forbice o con insetti può durare 15 min per pianta. Se possibile, numera le foglie della pianta da cui registrerai, scegli la foglia da ferire e le foglie da cui vuoi registrare. Immobilizza la foglia da ferire come descritto in precedenza, attendei 5 minuti, quindi posizionare il vaso contenente la pianta in modo tale che questa foglia sia facilmente accessibile dalla parte anteriore.

Posiziona l’elettrodo di terra nel terreno. Assicurati che l’elettrodo di terra non tocchi alcuna foglia. Posiziona gli elettrodi di registrazione nelle posizioni scelte sulle foglie, con le estremità curve rivolte verso le foglie (v. figura). L’elettrodo di registrazione non dovrebbe toccare la superficie fogliare per evitare danni alla cuticola. Pipetta quindi 10 µl di soluzione KCl / agar nello spazio tra l’elettrodo di registrazione e la superficie della foglia. La goccia KCl dovrebbe avere una forma rotonda con un diametro di circa 2 mm. La punta curva dell’elettrodo deve essere immersa nella goccia KCl / agar.

Realizzazione degli elettrodi e loro posizionamento a contatto del gambo della foglia. Vi è poi un ulteriore elettrodo nel terreno, l’elettrodo di massa.

La crescita delle piante dura 5 settimane. La preparazione quotidiana del setup, una volta che le soluzioni e gli elettrodi sono stati realizzati, dura circa 30 minuti e la registrazione del potenziale elettrico superficiale indotto da una ferita richiede circa 15 minuti per pianta. In particolare, il seguente è il protocollo di registrazione dei segnali vero e proprio da seguire:

  1. Commuta i canali di registrazione da “standby” a “operare” (o “registrare”). Regola l’offset di tensione sull’amplificatore per ciascun canale su 0.
  2. Osserva per 1-3 minuti la stabilità della linea di base. Ri-regola lo scostamento, se necessario.
  3. Se le letture della tensione sugli amplificatori sono stabili, avvia il protocollo di registrazione e registra l’andamento basale.
  4. Dopo aver registrato diverse decine di secondi della linea di base, applica la ferita sulla foglia o metti uno o più insetti (ad esempio bruchi) in un anello sulla foglia e copri la parte superiore per impedire che scappino.
  5. Effettua l’acquisizione del segnale per 15 minuti, dopodiché ripeti la procedura per la pianta successiva.

Per ottenere delle registrazioni riproducibili, è necessario prestare particolare attenzione ai seguenti aspetti. Le medesime condizioni di luce e temperatura presenti nella stanza di crescita devono essere fornite durante le registrazioni. Le piante devono essere coltivate in stanze senza insetti e devono essere in buona salute. Innaffia le piante il giorno prima dell’esperimento; durante l’esperimento il terreno deve essere umido ma le foglie non devono essere bagnate.

Una volta avviata la registrazione, il potenziale di superficie viene misurato e mostrato in tempo reale sullo schermo del computer dal software di acquisizione o, nel caso di Arduino, meglio ancora usando il software Meguno Link Pro, che abbiamo presentato qui. La figura qui sotto illustra una tipica registrazione di un cambiamento del potenziale superficiale indotto dalla ferita. I dati sono stati registrati con due elettrodi che sono stati posizionati sulle foglie di una pianta Arabidopsis.

Tracce da una tipica registrazione di cambiamenti del potenziale superficiale indotti dalla ferita. (a) Indicazione schematica del sito di ferita sulla foglia e delle posizioni dei due elettrodi di registrazione sulle foglie vicine mostrate. (b) Le tracce che tracciano il potenziale di superficie in funzione del tempo sono mostrate per le due posizioni degli elettrodi. La barra sopra le tracce indica il periodo di registrazione della linea di base (grigio) e di ferita da una pinza (nera).

Dopo circa 1 minuto di registrazione della linea di base, la foglia è stata ferita con la pinza di taglio. Dopo un breve intervallo, il potenziale superficiale è calato di oltre 50 mV. Questa ampiezza dipende dall’entità della ferita e dalla posizione dell’elettrodo. L’elettrodo 2 ha registrato una diminuzione del potenziale elettrico superficiale che è arrivata dopo e si è invertita più rapidamente rispetto al segnale nella foglia ferita.

Esperimenti con eccessivo rumore elettrico e con artefatti dovuti al contatto o all’avvicinamento dello sperimentatore e allo spostamento della foglia durante la ferita a causa di una insufficiente immobilizzazione della foglia o di una grave ferita. La traccia registrata con l’elettrodo e2 ha mostrato rumore elettrico e segnale instabile a causa di insufficiente clorurazione. Gli artefatti indotti dallo sperimentatore (toccando, avvicinandosi, ferendo) sono indicati da punte di freccia rosse.