Come “hackerare” il DNA con i kit CRISPR

Nella maggior parte dei settori scientifici, mettere le mani su una tecnologia all’avanguardia è difficile o impossibile. Nessun fisico di particelle fai-da-te è in grado di misurare la massa del bosone di Higgs nel proprio garage. L’accesso ai più potenti telescopi è difficile anche per gli astronomi professionisti. Ma questo non è necessariamente il caso della biologia. Con la tecnologia di editing genetico CRISPR / Cas9, puoi conoscere la scienza all’avanguardia facendola davvero: oggi si vendono kit per i bio-appassionati che desiderano armeggiare con DNA batterico, di lievito o animale diventando “biohacker”.

Alcuni batteri hanno sviluppato con l’evoluzione un potente sistema, chiamato CRISPR, per combattere le infezioni virali. Quando un virus colpisce, un batterio lo cattura e memorizza una breve sequenza identificativa del DNA del virus: una sorta di “Memory card” genetica. Se lo stesso virus attacca in futuro, generazioni di batteri usano la scheda di memoria per guidare un enzima killer all’identica sequenza in un nuovo invasore e tagliarla via, proteggendosi con un meccanismo naturale.

Gli scienziati hanno cooptato questi macchinari molecolari naturali non solo per disattivare l’azione di un gene, ma anche per inserire nuovo codice genetico in organismi viventi, compresi gli esseri umani. Perciò, il CRISPR ha innescato un’esplosione di ricerca e un acceso dibattito etico. Oggi i kit per il CRISPR sono liberamente acquistabili sul mercato e vengono usati per scopi educativi e per la progettazione di semplici microrganismi: di solito, vengono impiegati in lieviti e batteri, e cose del genere.

Uno dei kit per il CRISPR acquistabili su Internet.

Funzionamento e applicazioni della tecnologia CRISPR

Il CRISPR non è il primo strumento che gli scienziati hanno inventato per apportare modifiche ai genomi. Gli scienziati hanno usato le radiazioni e altri strumenti per manipolare i genomi da oltre cento anni. Ma quelle tecniche non hanno sempre apportato cambiamenti precisi. Potrebbero anche essere difficili e costose da usare. Più recentemente, gli scienziati nel campo della biologia molecolare hanno sviluppato degli strumenti più precisi per l’editing genetico, che usano la cosiddetta “nucleasi”.

Una nucleasi è una proteina speciale che riconosce una specifica sequenza di DNA e si lega (o si attacca) ad essa. Quando si lega, la nucleasi taglia il DNA. Il taglio del DNA consente agli scienziati di colpire luoghi molto specifici in un genoma per apportare modifiche. Ma tali strumenti erano difficili da usare negli esperimenti. Dovevano essere appositamente progettati per ogni cambiamento che si voleva apportare al genoma. La progettazione di nuove versioni di tali strumenti richiedeva molto tempo ed era costosa.

Come il CRISPR effettua il “taglio” del DNA.

L’RNA speciale è progettato per trovare la posizione in cui il CRISPR taglierà il DNA. Questo può rimuovere una sezione di DNA o aprire un punto per l’aggiunta di nuovo DNA.  Il CRISPR prende di mira e taglia luoghi molto specifici di un genoma. Non solo: rispetto ai metodi impiegati in precedenza, il CRISPR è diverso perché è più veloce, più economico e può essere utilizzato per molti scopi diversi. Il CRISPR utilizza un sistema in due parti, un enzima e un cosiddetto “RNA guida”.

Gli enzimi sono proteine ​​che le cellule producono per svolgere dei lavori specializzati. In questo caso, un enzima può essere usato per tagliare i filamenti di DNA. Ma come fa l’enzima a sapere dove tagliare? È qui che entra in gioco l’RNA. L’RNA è una sequenza di nucleotidi, simile al DNA, che può abbinarsi e legarsi a sequenze di DNA molto specifiche. La guida RNA specifica il luogo particolare in cui CRISPR deve mirare e quindi l’enzima cattura e taglia il DNA solo in quel sito specifico.

Il vantaggio del CRISPR è che gli scienziati possono facilmente scambiare l’RNA guida. Un RNA guida diverso può indirizzare una diversa sequenza di DNA. È una situazione simile, per certi versi, a quella di un trapano che ha molte punte (la piccola parte metallica che crea il foro) di dimensioni diverse che possono essere utilizzate per diversi tipi di lavori. Ciò rende più veloce, economico e semplice la progettazione di diversi strumenti CRISPR per effettuare molti tipi di esperimenti.

L’ingegneria genetica è da tempo usata all’estero con i giustamente contestati OGM.

Esistono, in effetti, diversi “strumenti” di modifica genetica, ma il CRISPR è di gran lunga il più conveniente e preciso. Funziona iniettando un costrutto di DNA con tre componenti principali in un organismo vivente. I componenti sono: (1) l’enzima Cas9 che taglia o elimina un segmento di DNA, (2) una sequenza di RNA che guida il Cas9 nella posizione corretta per il taglio; e (3) un nuovo modello di DNA con cui riparare il taglio. Vi sono molte cose che potremmo ottenere con il CRISPR o che già abbiamo.

CRISPR sta per “ripetizioni palindromiche brevi intervallate regolarmente raggruppate”.CRISPR cerca nel DNA dell’organismo una determinata sequenza, in particolare quella codificata dall’RNA guida, che contiene la sequenza inversa del DNA bersaglio. Il Cas9 apre il DNA, separa i fili della doppia elica in un’area molto piccola e consente alla guida RNA di accoppiarsi con uno dei fili. Se c’è una buona corrispondenza, si verifica il taglio. Se non è una buona corrispondenza, Cas9 e l’RNA guida riprovano altrove.

Il CRISPR agisce come una sorta di forbice sul DNA.

Quando trova la sequenza giusta, la proteina Cas9 taglia il DNA in quel punto preciso. A questo punto, se lasci sola la cellula, di solito riparerà in modo del tutto naturale il taglio del CRISPR, ma occasionalmente commetterà anche un errore nel processo di riparazione, rompendo un gene o altre parti del genoma. Poiché il CRISPR ritorna ripetutamente e taglia di nuovo il DNA dopo che la cellula lo ha riparato, il gene alla fine si rompe o, in termini tecnici, viene “eliminato”.

E, se aggiungi nuovo DNA, la cellula può incorporarlo mentre fissa il taglio. Ciò significa che è possibile inserire il DNA nel punto desiderato nel genoma, è sufficiente conoscere la sequenza genetica dell’organismo dell’area target desiderata (cosa ovviamente non alla portata di uno scienziato dilettante). Dunque, si può utilizzare il CRISPR per eseguire praticamente qualsiasi esperimento sul vivente che si voglia. E ora ha reso l’ingegneria genetica più semplice che mai.

Nei tre anni successivi alla pubblicazione dei primi articoli scientifici sul CRISPR, sono state affrontate, a livello di ricerca, numerose domande. Vuoi coltivare funghi più stabili o mais a resa più elevata? Il CRISPR ha aiutato in questo. Vuoi riportare in vita mammut lanosi? Il CRISPR ha avvicinato gli scienziati a questo obiettivo. Molti si aspettano che un giorno il CRISPR avrà un impatto drammatico sulla medicina. Oggi viene utilizzato per colpire l’HIV, l’Alzheimer e vari tipi di cancro.

L’intervento sugli embrioni umani è l’ultimo tabù dell’ingegneria genetica.

Le applicazioni della tecnologia CRISPR sono davvero numerose. Eccone alcune:

• Prevenzione delle malattie. La tecnologia di editing del genoma sta rivelando quali sequenze del DNA sono coinvolte, ad esempio, in malattie come l’AIDS.
• Trattamento del cancro. Si possono usare tecnologie di modifica genetica nel tentativo di uccidere in modo più efficace le cellule di leucemia senza attaccare il corpo del paziente.
• Alterazione dell’ecologia. La diffusione del vettore di malattie come la malaria potrebbe venire ridotta introducendo geni resistenti alle malattie nelle popolazioni di insetti selvatici.
• Fornire organi all’uomo. La CRISPR permette di modificare molti geni nelle cellule di maiale contemporaneamente, e rendere gli organi di suino adatti al trapianto nell’uomo.
• Trasformazione del cibo. Il CRISPR potrebbe essere usato per sviluppare colture resistenti alla siccità o comunque colture più forti. Funghi CRISPR sono già stati approvati negli Stati Uniti.
• Creare delle super-piante. I ricercatori stanno sperimentando modi per migliorare la resistenza alle malattie delle colture e la tolleranza allo stress ambientale usando il CRISPR.
• Editing sugli esseri umani. Esperimenti con gli embrioni non vitali dimostrano che molto lavoro dovrà essere fatto – e molte domande ricevere risposta, prima che il CRISPR possa essere usato per modificare gli umani.

Lo strumento di modifica genetica ha anche sollevato preoccupazioni sulla creazione di “designer bambini”. Sono stati approvati esperimenti in Svezia, Cina e Regno Unito per tentare l’editing genetico di embrioni umani. Un team vuole correggere una mutazione che causa una malattia del sangue, un altro vuole introdurre una mutazione che rende l’uomo resistente all’infezione da HIV. Ma lasciamo da parte il potenziale pericolo di un futuro con organismi progettati geneticamente.

Come ingegnerizzare geneticamente un organismo

Il CRISPR è all’avanguardia, ed è così accessibile che puoi usarlo a casa tua, sul tavolo della tua cucina. Puoi imparare sulla scienza all’avanguardia facendola realmente. Il primo kit CRISPR per il grande pubblico è stato sviluppato da Josiah Zayner, biologo che aveva recentemente lasciato il suo lavoro come biologo sintetico alla NASA per diventare un “biohacker” a tempo pieno. La maggior parte dei kit di Zayner hanno applicazioni limitate. Ad esempio, non è possibile utilizzarli per modificare i propri geni.

Uno dei kit commercializzati dal brillante biologo americano.

Uno dei kit principali di Zayner include tutto il necessario per apportare modifiche di precisione al genoma nei batteri domestici, tra cui Cas9, tracrRNA, crRNA e template DNA per un esperimento esemplificativo. Include un esperimento esemplificativo per effettuare una mutazione del genoma (K43T) nel gene rpsL modificando il 43-esimo aminoacido, una lisina (K) in una treonina (T), permettendo così ai batteri di sopravvivere sui terreni di coltura che normalmente ne prevengono la crescita.

Il kit di Zayner ti consente di ingegnerizzare ad es. i batteri E. coli in modo che possano vivere su un mezzo nutritivo dove altrimenti non potrebbero. Usando il kit su un lievito, dopo il primo giorno si può già mostrare che il lievito può crescere sulla sostanza a destra (è rappresentato dalle linee biancastre in figura), ma non è stato in grado di crescere sulla sostanza a sinistra. Successivamente, altera il DNA del lievito per renderlo in grado di crescere sulla sostanza per lui tossica.

L’esperimento sull’ingegnerizzazione di microorganismi descritto nel testo.

L’idea alla base dell’esperimento con il batterio E.Coli, eseguibile con il medesimo kit di Zayner, è abbastanza semplice. L’obiettivo è modificare l’E. Coli in modo che possa crescere su un antibiotico chiamato streptomicina, che normalmente uccide i batteri. Con i materiali e le istruzioni del kit, introduci il CRISPR nelle cellule batteriche e lo usi per riscrivere una piccola parte del loro DNA, creando cellule geneticamente modificate che prosperano felicemente con la streptomicina.

Infatti, il CRISPR rintraccerà e poi cambierà solo una singola coppia di basi (che sono i mattoni per il DNA) su 4,6 milioni di coppie di basi nel genoma di E. coli. Sostituirà l’adenina chimica composta con citosina o, in termini di alfabeto genetico, una “A” per una “C.” A causa di quel piccolo cambiamento di codice, le cellule batteriche produrranno l’amminoacido lisina invece di un’altro, la treonina. Se il tuo editing genetico ha successo, questo impedirà alla streptomicina di interferire con l’E. Coli.

Il CRISPR permette di fare un preciso editing genetico.

Per quanto riguarda la sicurezza, è difficile garantire che tutto sia “totalmente sicuro”. Detto questo, nulla di ciò che ci viene inviato nella confezione è una sostanza controllata. Ad esempio, il ceppo batterico nel kit (E. coli HME63) è classificato come livello di biosicurezza 1 (BL1), il che significa che non provoca malattie nell’uomo. L’agar (il “gelatina nutriente”) è una sostanza gelatinosa che proviene dalle alghe. È usato nella cucina asiatica e per curare il diabete e la costipazione.

Per fare l’esperienza, è largamente opportuno indossare guanti protettivi e pulire il proprio spazio di lavoro, attuando le migliori pratiche che insegnano alle lezioni di laboratorio di biologia. Ora, gli atteggiamenti di Zayner differiscono dagli altri nella comunità biologica fai-da-te. Ad esempio, i suoi video tutorial mostrano che il materiale di laboratorio viene conservato nel congelatore, nel frigorifero o nel piano di lavoro della cucina. Altri membri della comunità di biologia del fai-da-te disapprovano tali pratiche.

L’esperimento con il kit CRISPR può essere fatto perfino in cucina.

Le discussioni su come dovrebbero comportarsi i biologi del fai-da-te probabilmente scateneranno, così come le questioni su come l’ingegneria genetica e i suoi prodotti dovrebbero essere regolati. Nel frattempo, la compagnia di Zayner “The Odin” sta lottando per tenere il passo con la domanda di kit. Il kit è molto completo, utile per chi non ha altre attrezzature o risorse di laboratorio. È inoltre bello vedere che è ora disponibile un kit di sostituzione dei materiali deperibili per chi vuole ripetere gli esperimenti.

Un altro kit prodotto dalla stessa azienda permette di ingegnerizzare i lieviti della fermentazione per produrre un liquido fluorescente, ma con un altro è anche possibile creare batteri bioluminescenti. Vi è un kit dedicato alla modifica genetica dei funghi. Per chi vuole osare di più, c’è anche un kit per chi vuole modificare geneticamente le rane. Si può pure acquistare la linea cellulare delle cellule umane di rene. E, per 500 dollari, vende anche una macchina per fare la PCR, cioè l’amplificazione del DNA.

In basso, la macchina per PCR venduta dall’azienda.

Per il tuo esperimento, tutto ciò di cui hai bisogno ti arriva in una piccola scatola di cartone: un assortimento di bottiglie, provette, capsule di Petri, polveri e liquidi (più l’organismo da modificare). Zayner, che ha un dottorato di ricerca in biofisica molecolare, ha inizialmente condotto una campagna di crowdfunding raccogliendo oltre $ 70.000 ed ha venduto così subito 250 kit CRISPR fai-da-te, e in poco tempo ha venduto oltre un migliaio di kit, molti dei quali acquistati da scuole.

Certo, con i kit tutto è predeterminato, con le istruzioni fornite per voi come passaggi in un libro di cucina: “Aggiungi 100 microlitri Mix di trasformazione in una nuova provetta da centrifuga”, “Incuba questa provetta in frigorifero per 30 minuti” e così via. Alla fine, avrai preso zero decisioni. Ovviamente, potresti progettare un esperimento CRISPR su misura, ma ti ci vorrebbe più tempo, più materiali, più soldi e, assai verosimilmente, molte più conoscenze di quelle che hai attualmente.

Un kit CRISPR per creare batteri bioluminescenti.

Fino al CRISPR, gli scienziati del fai-da-te non avevano un modo semplice, economico o affidabile per modificare con precisione il DNA. Molti di loro non potevano permettersi gli strumenti costosi e imperfetti che gli scienziati professionisti utilizzavano per l’editing genetico in quel momento. Ma con il CRISPR è molto più conveniente, soprattutto se vuoi provare un esperimento più di una volta. Con il CRISPR, puoi provare un esperimento più volte. Già questo da solo è un grosso problema risolto.

Ciò significa che CRISPR offre agli amanti del bricolage un modo completamente nuovo di fare scienza. Molti biohacker dilettanti – che si stanno diffondendo nel mondo e spesso collaborano insieme – hanno provato il CRISPR in diversi modi: tagliando il genoma del lievito, tagliando il DNA all’interno delle cellule di E. coli e tentando di modificare il sistema CRISPR restringendolo o attaccando altre molecole ad esso. Ma come si fa a sapere se, ad esempio, il CRISPR ha tagliato il DNA del proprio lievito? Con l’elettroforesi.

Infatti, basta tingere di blu la propria miscela DNA-CRISPR e farla passare attraverso un gel caricato elettricamente, che separa i pezzi di DNA più grandi da quelli più piccoli, per cui i fili di DNA tagliati vengono “tirati” verso il lato caricato positivamente. Se il nostro esperimento ha avuto successo, dovremmo vedere due bande blu per i brevi filamenti di DNA tagliati dal CRISPR in un punto e una banda blu per un pezzo di DNA più lungo, non tagliato (il nostro controllo) in un’altra posizione.