Come fare la PCR per moltiplicare il DNA

L’era della biotecnologia è ben avviata. Ma, come l’Era del Silicio, esploderà davvero nella crescita solo quando il prezzo di entrata per lo scienziato dilettante raggiungerà un punto in cui alcuni studenti universitari potranno permettersi di costruire un laboratorio di biotecnologia nel seminterrato dei loro genitori e, con le loro invenzioni, “conquistare” il mondo aprendo nuove strade. Ebbene, una macchina per la PCR, in grado di moltiplicare il DNA così da produrne quantità utilizzabili in laboratorio, può oggi essere realizzata da un dilettante con una spesa di pochi euro, e gli apre un “nuovo mondo”.

Il laboratorio di biotecnologia sta diventando sempre più snello, e gli esperimenti che una volta avrebbero richiesto settimane o mesi possono essere eseguiti in pochi giorni, con tecniche di DNA ricombinante molto migliorate, consegna il giorno successivo di “primer” di DNA e sintesi genica a basso costo. Sebbene ora possiamo dimenticare molte tecniche antiquate (ma ancora ampiamente utilizzate), l’unica tecnica che ha dato il via alla rivoluzione biotecnologica è ancora una necessità assoluta: la PCR.

La PCR viene utilizzata in biologia per amplificare piccole quantità di DNA a livelli misurabili. Le applicazioni includono test per i geni dell’HIV nel sangue, amplificazione del DNA da una scena del crimine, test per specifici alleli della malattia e determinazione della paternità. Il dispositivo che illustriamo in questo articolo potrebbe essere utilizzato nelle scuole, in laboratori con un basso budget come quelli nei paesi in via di sviluppo e, naturalmente, per l’utilizzo da parte dello scienziato dilettante, a casa.

Alcuni dei numerosi impieghi di questa tecnica.

La reazione PCR: cosa è, quali applicazioni ha

La PCR, in pratica, è una tecnica per eseguire molte copie di una specifica regione del DNA “in vitro” (cioè in una provetta anziché in un organismo). Come vedremo, la PCR si basa su una DNA polimerasi termostabile, Taq polimerasi, e richiede “primer” per DNA progettati specificamente per la regione di DNA di interesse. La PCR ha molte applicazioni pratiche al giorno d’oggi. Viene infatti regolarmente utilizzata nella clonazione del DNA, nella diagnostica medica e nell’analisi forense del DNA.

La PCR, o Polymerase Chain Reaction, è una delle più grandi invenzioni del 20° secolo. Con essa possiamo prendere una singolo pezzo di DNA e farne trilioni di copie identiche. Con queste, possiamo identificare un assassino da un granello di pelle, il codice a barre costituito dal DNA delle creature viventi per studiare interi sistemi ecologici o la causa di una malattia per la medicina personalizzata. E possiamo persino scambiare il “codice” della vita tra le specie, riscrivendo il DNA degli organismi viventi.

La regione del DNA che viene moltiplicata può essere qualsiasi cosa che interessi allo sperimentatore. Ad esempio, potrebbe essere un gene di cui un ricercatore vuole capire la funzione, o un marcatore genetico utilizzato dagli scienziati forensi per abbinare il DNA della scena del crimine con i sospetti. In genere, l’obiettivo della PCR è quello di creare abbastanza quantità di materiale della regione del DNA target da poter essere analizzata oppure utilizzata in qualche altro modo.

La PCR è il processo di copia del DNA, che di solito segue l’estrazione con l’aiuto di una centrifuga e precede la visualizzazione con l’elettroforesi su gel.

Ad esempio, il DNA amplificato dalla PCR può essere inviato a una macchina di livello professionale per il sequenziamento, oppure visualizzato mediante elettroforesi su gel (vedi il nostro articolo Come visualizzare il DNA con l’elettroforesi su gel, che trovi qui) o, ancora, clonato in un plasmide per ulteriori esperimenti. La PCR è utilizzata in molte aree della biologia e della medicina, compresa la ricerca in biologia molecolare, la diagnostica medica e persino alcuni rami dell’ecologia.

Una macchina per PCR fai-da-te è più semplice di quanto potresti pensare. Avrai bisogno di un tubo in PVC da 10 cm, una lampadina, una ventola da computer, una punta da trapano e un po’ di elettronica. Tutto sommato, se hai già alcune delle cose (come l’accesso a un trapano), puoi realizzare la tua macchina per PCR con pochi euro. Non male, considerando che una normale macchina PCR può costare da svariate centinaia di euro per quelle dilettantistiche fino alle migliaia di quelle professionali.

Creare apparecchiature di laboratorio significa lavorare con l’elettronica. Ciò significa fare cablaggi, eventualmente programmazione (in alcuni casi) e avere altri tipi di expertise che per il biologo dilettante potrebbero non essere così importanti. Le guide per molte macchine per PCR fai-da-te sono abbastanza dettagliate, ma sebbene fantastiche sono praticamente inutili per un principiante, data la poca informazione che hanno. Qui cercheremo di colmare tale lacuna.

Guida alla realizzazione di una macchina per PCR

Un macchina per PCR è l’equivalente nella biologia di una fotocopiatrice da ufficio. La PCR, abbreviazione di “reazione a catena della polimerasi”, è ora un punto fermo nella scienza forense della scena del crimine, nei test di ereditarietà e nell’ingegnerizzazione genetica degli organismi. Tra miliardi di coppie di basi che compongono il codice genetico del DNA, la PCR trova sequenze esatte e, in un paio d’ore, crea miliardi di copie, abbastanza per decodificare o combinare utili combinazioni di geni.

La macchina per PCR fai-da-te che illustreremo in questo articolo.

Quello che ti occorre per realizzare una macchina per PCR è il seguente materiale:

  • Alcuni tubi in PVC
  • Una lampadina da 150 watt
  • Una ventola del computer
  • Un microcontrollore economico (da es. Arduino Uno)
  • Alcuni reagenti che puoi ordinare online.

Impila cinque pezzi di tubo in PVC per formare un silos che contiene provette di DNA, le riscalda con una lampadina e le raffredda con una ventola del computer. Pratica una dozzina di fori di circa 0,6 cm nella parte superiore di un adattatore inclinato (per trattenere altrettante fiale), inserisci un tubo più stretto internamente alla base dell’adattatore e, infine, taglia un foro quadrato nel tubo in PVC esposto in modo che corrisponda alla porta di scarico della ventola del computer.

Taglia la stessa porta quadrata nella parte superiore di un raccordo dritto in PVC e incolla a caldo la ventola in posizione. Pratica poi un foro nel lato del tubo interno che fa da giunto, appena sopra il centro del silos, e imbullona un portalampada in modo che sia ben bloccato. Per quanto riguarda la parte in basso del sistema, dovrai semplicemente  praticare un foro in un secondo giunto per avere un fascio di fili che porta l’alimentazione elettrica a un microcontrollore Arduino Uno o equivalente.

Schema della macchina per PCR illustrata nel testo.

Collegare il cavo che alimenta la lampadina e la ventola del computer ai relè a 5 volt e collega questi e il cavo lasciato libero (uno va invece al relé) ad Arduino. Collega Arduino a una fonte di alimentazione a 5 V fornita da una porta USB oppure da un trasformatore. Collega un termistore ad Arduino. Inserisci il termistore in una fiala contenente olio minerale e acqua e posizionalo in un foro per fiala. Ciò fornisce i dati di temperatura ad Arduino, permettendogli di accendere e spegnere la lampadina e il calore.

Puoi modificare il progetto di base appena illustrato che utilizza Arduino per controllare, ad esempio, due resistenze ad alta potenza per riscaldare il campione, sempre una ventola del computer per raffreddare e usare una termocoppia anziché un termistore per tenere traccia della temperatura. Un diverso design più semplice potrebbe supportare due campioni alla volta, anche se probabilmente potrebbe essere esteso per supportarne di più, in base a quelle che sono le tue esigenze reali.

L’idea di base è che invii la corrente attraverso le resistenze per riscaldarsi (impostando un pin di Arduino su alto in modo da comandare il relé); e accendi la ventola per raffreddarle (impostando un altro pin 9 di Arduino su alto, che comanda un altro relé). È possibile controllare la temperatura grazie alla termocoppia. La cosa principale è non surriscaldare le resistenze e il campione. Non si vuole mai lasciare che la corrente passi attraverso le resistenze per lunghi periodi di tempo.

Schema più generale di un apparato fai-da-te per la PCR.

La termocoppia non risponderà istantaneamente alle variazioni di temperatura. Il codice Arduino per il “riscaldamento” potrebbe quindi far scorrere la corrente attraverso le resistenze per circa mezzo secondo e poi controllare la termocoppia. Ogni 15 secondi, il sistema si blocca e attende il raggiungimento di una temperatura costante. Ciò assicura che possiamo rilevare i ritardi della termocoppia e lasciare che il sistema si riscaldi uniformemente. Il codice dovrebbe avere controlli per assicurarsi che la termocoppia sia correttamente collegata, non si riscaldi troppo velocemente, non si surriscaldi, etc.

Una buona macchina per PCR, infatti, deve riscaldare o raffreddare ad una velocità di almeno 3-4 gradi Celsius al secondo, e questo richiede molta potenza. Ma dobbiamo raggiungere queste temperature in modo rapido e preciso, e ciò significa utilizzare delle resistenze elettriche, oppure dispositivi ad effetto Peltier grandi e affamati di energia per riscaldare e raffreddare rapidamente la nostra miscela di reazione. Come sappiamo, il calore è la chiave della reazione della PCR e il passaggio da una temperatura alla successiva attraverso il ciclo guida la reazione a livello molecolare.

Sia che tu stia testando cereali per la colazione per realizzare cereali modificati geneticamente o controllando te stesso per valutare la resistenza all’HIV, scegli un gene da copiare e dunque moltiplicare. Dovrai ordinare da Internet i reagenti in grado di dirottare le molecole che copiano il DNA. Le macchine per PCR, infatti, effettuano un ciclo della temperatura per abilitare i reagenti alla copia del DNA, inclusi primer, nucleotidi e l’enzima Taq polimerasi. Sono dunque dei “termociclatori”.

Uno dei kit di reagenti (e non solo) per la PCR in vendita sul web.

Come funziona la PCR con un termociclatore?

Ma come funziona esattamente la PCR? La PCR consiste in 3 passaggi che vengono ripetutamente ciclicamente da una macchina per PCR: denaturazione, ricottura e estensione, con quest’ultima che di fatto moltiplica materialmente il DNA. Ognuna di queste fasi può essere lunga 20-30 secondi e venire ripetuta più di 30 volte, a seconda del protocollo. La maggior parte dei protocolli suggerisce inoltre di avere una fase di denaturazione iniziale più lunga e una fase di estensione finale più lunga.

Come la replicazione del DNA in un organismo, la PCR richiede un enzima DNA polimerasi che crea nuovi filamenti di DNA, usando filamenti esistenti come modelli. La DNA polimerasi tipicamente usata nella PCR è chiamata “Taq polimerasi”, dal nome del batterio termoresistente da cui è stata isolata (Thermus aquaticus). La sua DNA polimerasi è molto stabile al calore ed è più attiva intorno a 70 °C, una temperatura alla quale una DNA polimerasi umana o di E. coli non funzionerebbe.

Come le altre DNA polimerasi, la Taq polimerasi può produrre DNA solo se gli viene dato un “primer”, cioè una breve sequenza di nucleotidi che fornisce un punto di partenza per la sintesi del DNA. In una reazione di PCR, lo sperimentatore stesso determina la regione del DNA che verrà copiata o amplificata dai primer che sceglie: questa è dunque una cosa molto importante da tenere sempre presente. I primer per PCR sono brevi frammenti di DNA a singolo filamento, di solito lungo circa 20 nucleotidi.

L’andamento della temperatura in una macchina per la PCR.

In ogni reazione di PCR vengono utilizzati due primer, progettati in modo da affiancare la regione “target” (cioè la regione che deve essere copiata). In pratica, vengono fornite sequenze che li legheranno a filamenti opposti del DNA modello, proprio ai bordi della regione da copiare. I primer si legano al modello mediante l’associazione di basi complementari. Quando i primer sono legati al modello, possono essere “estesi” dalla polimerasi e la regione che si trova tra loro verrà copiata.

Durante la PCR, una miscela di DNA, primer e DNA polimerasi viene ciclata tra tre diverse impostazioni di temperatura. Alla temperatura di 94°C, il DNA viene separato temporaneamente in due filamenti, come una cerniera che si apre. I primer sono degli inneschi: piccoli frammenti di DNA che “innescano” la replicazione, alla temperatura di 55 °C si attaccano alle estremità di un gene. Alla temperatura di 72 °C, la Taq polimerasi riconosce gli inneschi, si aggancia e copia il DNA nella sequenza target.

Le tre fasi di una reazione PCR che compongono un singolo ciclo.

In pratica, la fase di denaturazione consiste nel riscaldare a 94–98 °C per 20-30 secondi: essa causa la fusione del DNA del modello di DNA interrompendo i legami idrogeno tra basi complementari, producendo molecole di DNA a singolo filamento. Nella fase di ricottura, la temperatura di reazione viene abbassata a 50-65 °C per 20-40 secondi, consentendo la ricottura dei primer sul modello di DNA a singolo filamento. I legami idrogeno DNA-DNA stabili si formano solo quando la sequenza del primer si avvicina molto alla sequenza del modello. La polimerasi si lega all’ibrido primer-template e inizia la formazione del DNA.

Nella fase di estensione, la temperatura in questa fase dipende dalla DNA polimerasi utilizzata: la Taq polimerasi ha la sua temperatura di attività ottimale a 75-80 °C, e comunemente viene utilizzata una temperatura di 72 °C con questo enzima. A questo punto la DNA polimerasi sintetizza un nuovo filamento di DNA complementare al filamento di DNA template aggiungendo dNTP complementari al template. Quindi, la temperatura deve passare da 95 °C a 60 °C a 72 °C per circa 30 cicli.

Nel dettaglio, le macchine per la reazione a catena della polimerasi funzionano facendo ciclare una miscela di DNA-modello (che contiene la parte di DNA che vogliamo copiare), Primer (frammenti di DNA corti ed economici che corrispondono alla parte anteriore e posteriore della sequenza che stiamo copiando), Polimerasi (il bio-nanobot che esegue la copia) e, infine, nucleotidi chimici grezzi che costituiranno i mattoncini con cui realizzare materialmente la sequenza delle copie.

Una macchina per la PCR per uso didattico in vendita sul web a circa 500 euro.

Come analogia, infatti. pensa al modello come a un libro, ai primer come a una serie di segnalibri per determinate pagine e alla polimerasi come a una fotocopiatrice. I nucleotidi grezzi sono quindi qualcosa di simile alla carta bianca. La PCR sfrutta il fatto che alcune polimerasi presenti negli organismi estremofili provenienti da prese d’aria vulcaniche o sorgenti calde sottomarine possono operare a temperature molto elevate, in cui la maggior parte degli organismi sarebbe ben cotta.

Continuando con l’analogia, immagina di riscaldare il modello come se stesse aprendo il libro. Il raffreddamento del libro inserisce i segnalibri nella posizione corretta e lo chiude, e ora puoi consegnarlo al ragazzo alla fotocopiatrice, in modo che fotocopi tutto ciò che vi è tra i segnalibri. Quindi, gran parte del duro lavoro nella macchina per PCR è svolto dal meraviglioso enzima Polimerasi, e la macchina per PCR deve solo riportare tutto alla giusta temperatura al momento giusto.

Se la reazione è efficiente (funziona bene), la regione target può passare da una o poche copie a miliardi. Questo perché non è solo il DNA originale che viene utilizzato come modello ogni volta. Invece, il nuovo DNA che viene prodotto in un ciclo può servire da modello nel prossimo round di sintesi del DNA. Esistono molte copie dei primer e molte molecole di Taq polimerasi che fluttuano nella reazione, quindi il numero di molecole di DNA può raddoppiare all’incirca in ogni ciclo, con una crescita esponenziale.

L’aumento del numero di molecole di DNA a ogni ciclo della PCR.

Nei primi cinque minuti, la PCR realizza due copie di un gene. I successivi cicli di 30 secondi continuano il raddoppio. Dall’ottavo ciclo, esistono 256 copie genetiche e dal 30-esimo ciclo, ovvero 2-3 ore dopo, ce ne sono più di un miliardo. Il numero di cicli necessari varia tra 25 e 40 a seconda del numero di molecole bersaglio nella reazione iniziale. Puoi dunque creare milioni di copie di una sequenza bersaglio e ad es. puoi usare la PCR per clonare il tuo DNA, per testare un campione di DNA per un gene specifico, ad esempio, per verificare la presenza di alterazioni genetiche negli alimenti e per test genetici ereditari.

Infatti, I risultati della PCR possono essere visualizzati mediante elettroforesi su gel. I campioni di DNA vengono caricati in un gel e ad esso viene applicata un’alta tensione. Poiché il DNA è caricato negativamente, viaggerà attraverso il gel a velocità diverse a seconda delle sue dimensioni. Questo processo separa efficacemente i pezzi desiderati e puoi vederli macchiando il gel. Abbiamo già illustrato come fare un sistema per l’elettroforesi su gel del DNA in un articolo che trovi qui.