Come fare esperimenti di elettrofisiologia

L’elettrofisiologia è il campo di ricerca che studia le variazioni di corrente o tensione attraverso una membrana cellulare. Le tecniche di elettrofisiologia sono usate in una vasta gamma di neuroscienze e applicazioni fisiologiche: dalla comprensione del comportamento dei singoli canali ionici in una membrana cellulare, ai cambiamenti nel potenziale di membrana di una cellula, a quelli su larga scala del potenziale di campo all’interno delle fette cerebrali in vitro o delle regioni cerebrali in vivo. In questo articolo vedremo come allestire un piccolo laboratorio di elettrofisiologia e le principali tecniche usate.

L’elettrofisiologia è la branca della fisiologia che riguarda il flusso di ioni (corrente ionica) nei tessuti biologici e, in particolare, le tecniche di registrazione elettrica che consentono la misurazione di questo flusso. Le tecniche di elettrofisiologia classica prevedono il posizionamento di elettrodi in varie preparazioni di tessuto biologico. I principali tipi di elettrodi sono: conduttori solidi semplici, come aghi o tubi cavi riempiti con un elettrolita, come ad es. una soluzione di cloruro di potassio.

I preparati principali studiati includono: organismi viventi, tessuto asportato (acuto o in coltura), cellule dissociate dal tessuto asportato (acuto o in coltura), cellule o tessuti coltivati artificialmente, o ibridi di cui sopra. Infatti, se un elettrodo ha un diametro abbastanza piccolo (micrometri), l’elettrofisiologo può scegliere di inserire la punta in una singola cella. L’elettrofisiologia neuronale, in particolare, è lo studio delle proprietà elettriche delle cellule e dei tessuti biologici del sistema nervoso.

Preparazione di una micropipetta da usare per misurazioni di elettrofisiologia.

Il sistema nervoso è caratterizzato da segnali elettrici che vengono inviati da un’area all’altra. La base del segnale elettrico è la distribuzione controllata degli ioni attraverso la membrana cellulare. I canali ionici transmembrana regolano quando gli ioni possono muoversi all’interno o all’esterno della cellula, in modo da generare un segnale preciso, il “potenziale d’azione”, che ha una forma molto caratteristica basata sulle variazioni di tensione attraverso la membrana in un determinato periodo di tempo.

Il setup standard per esperimenti di elettrofisiologia

Ogni configurazione del laboratorio elettrofisiologico è diversa, riflettendo i requisiti dell’esperimento o le preferenze dello sperimentatore. Qui descriviamo i componenti e le considerazioni comuni a tutte le configurazioni dedicate alla misurazione dell’attività elettrica nelle celle. Una configurazione elettrofisiologica ha quattro requisiti di laboratorio principali:

  • Ambiente – i mezzi per mantenere sano il preparato;
  • Ottica – un mezzo per visualizzare la preparazione;
  • Meccanica – un mezzo per posizionare stabilmente il microelettrodo;
  • Elettronica – un mezzo per amplificare e registrare il segnale.

L’illustrazione seguente mostra il setup standard per l’elettrofisiologia: un tavolo e una gabbia di Faraday per proteggere il setup da interferenze esterne; un microscopio con micromanipolatore per posizionare stabilmente il microelettrodo; un amplificatore per raccogliere e amplificare i segnali acquisiti; un digitalizzatore per convertire i segnali analogici in digitali e un software di acquisizione e analisi dei dati, sia per impostare i protocolli sperimentali sia per estrarre dei risultati dai dati raccolti.

La configurazione standard di un laboratorio di elettrofisiologia.

Ecco, più in dettaglio, la funzione dei vari apparati mostrati nella figura:

1 – Amplificatore – Il luogo ideale per amplificare il segnale è all’interno dello strumento di registrazione, che nel nostro caso è il patch clamp. L’amplificatore del patch clamp serve per misurare le variazioni di corrente o tensione. Esso contiene i circuiti necessari per misurare la corrente che passa attraverso la membrana cellulare sia in grandezza che in direzione. L’amplificatore può anche misurare il potenziale della membrana cellulare in risposta al movimento della corrente.

Per avviare il movimento della corrente, lo sperimentatore può fornire un comando di tensione alla cellula e la cellula risponderà facendo passare la corrente necessaria per mantenere quel comando di tensione. Al contrario, lo sperimentatore può anche iniettare corrente e poi misurare la variazione del potenziale di membrana risultante da tale variazione di corrente. Scegliere dove amplificare e filtrare il segnale di interesse ha implicazioni sulla fedeltà del segnale.

Il controllo del guadagno dell’amplificatore è variabile sull’uscita per fornire un’amplificazione a basso rumore della corrente della pipetta o del potenziale di membrana. Il posizionamento dell’amplificazione all’interno dello strumento di registrazione riduce al minimo la quantità di circuiti tra il segnale di basso livello e i circuiti di amplificazione, riducendo quindi le fonti di rumore estraneo.

Un esempio di amplificatore differenziale con filtri per uso in elettrofisiologia.

2 – Digitalizzatore – Il digitalizzatore, o convertitore analogico-digitale (ADC), è uno strumento di acquisizione dati che converte i segnali analogici in segnali digitali. La corrente acquisita dall’amplificatore è un segnale analogico, ma per eseguire l’analisi dei dati necessaria per le misure di patch clamp ad alta risoluzione, il segnale analogico deve essere convertito in un segnale digitale. Posizionato tra l’amplificatore e il computer, il digitalizzatore svolge questo importante compito.

La qualità del segnale che il computer riceve è straordinariamente importante e questa è determinato dalla frequenza di campionamento o in inglese sampling rate. I digitalizzatori di ultima generazione usati dai professionisti hanno la capacità di campionare a 500 kHz (che vuol dire poter raggiungere la metà della frequenza di campionamento, ovvero 250 kHz, come limite max per l’analisi spettrale) e sono dotati di un filtro che può eliminare il rumore a frequenza di rete (50/60 Hz).

3 – Software – Il software di acquisizione e analisi dei dati del patch clamp è la tua interfaccia con l’amplificatore, il digitalizzatore e qualsiasi altra elettronica del patch clamp. Esso serve per eseguire l’acquisizione e l’analisi dei dati, nonché per controllare il digitalizzatore e l’amplificatore, in modo da fornire i potenziali desiderati e misurare la corrente o la tensione risultanti. Inoltre, il software analizza il segnale acquisito con impostazioni definite dall’utente, che possono includere filtraggio, normalizzazione, rimozione del rumore, adattamento della curva e determinazione dei parametri.

Un’alternativa gratuita ai software commerciali di elettrofisiologia.

4 – Headstage – Si tratta di un dispositivo che contiene le micropipette con i circuiti integrati per trasmettere i segnali elettrici dalle micropipette all’amplificatore. Infatti, il segnale elettrico acquisito dalla micropipetta deve essere trasmesso ai sistemi di amplificazione per l’elaborazione del segnale. Ogni headstage è specificamente sintonizzato per l’amplificatore. Tutti gli headstage contengono circuiti elettrici critici che riducono il rumore e sono controllati meccanicamente dal micromanipolatore.

5 – Microscopio con micromanipolatore – Il microscopio è uno strumento di ingrandimento ottico. Il micromanipolatore è un dispositivo che manovra meccanicamente la micropipetta con precisione nanometrica, in genere consentendo movimenti tridimensionali. Questo apparato permette di posizionare la micropipetta in modo preciso e stabile nell’area della membrana cellulare, cosa che risulta essere naturalmente fondamentale per una registrazione corretta dei segnali elettrici.

Il posizionamento accurato di un elettrodo patch su una cella da 10-20 µm richiede un sistema ottico in grado di ingrandire fino a 300 o 400 volte con miglioramento del contrasto e un micromanipolatore che posiziona stabilmente l’elettrodo nello spazio 3D. È preferibile un microscopio invertito, perché consente un accesso più facile per gli elettrodi da sopra la preparazione e fornisce anche una piattaforma più grande e più solida per imbullonare il micromanipolatore. Il micromanipolatore ha la capacità di spostare l’elettrodo a distanze molto ridotte lungo gli assi X, Y e Z.

Un apparato professionale con elettrodi patch per misurazioni di elettrofisiologia.

6 – Gabbia di Faraday – Un tavolo antivibrazioni con una gabbia di Faraday attorno alla configurazione del patch-clamp servono per isolare le principali fonti di interferenza esterne: i campi elettromagnetici e le vibrazioni. Infatti, le correnti elettriche misurate durante gli esperimenti di patch-clamp possono essere estremamente piccole (nella gamma dei pico-ampere) e qualsiasi piccola fonte di interferenza – come ad es. le onde a radiofrequenza – può distorcere od oscurare questi segnali.

Una gabbia di Faraday è una rete metallica attorno al microscopio e alla camera di registrazione; è utile per impedire agli elettrodi di captare fonti di rumore estranee. Inoltre, piccole fonti di vibrazioni nell’ordine di grandezza del picometro possono interrompere la registrazione. Pertanto, tutti i componenti devono essere posizionati perfettamente nel corso dell’esperimento e si usano tavoli antivibrazioni per isolare la configurazione da fonti esterne di vibrazione che potrebbero turbare l’allineamento.

La membrana cellulare e lo studio dei canali ionici

La maggior parte delle cellule del corpo utilizza particelle cariche, ioni, per accumulare una carica attraverso la membrana cellulare. Ad esempio, questo fa parte del funzionamento delle cellule muscolari: infatti, affinché i muscoli scheletrici si contraggano, in base all’accoppiamento eccitazione-contrazione, è necessario un input da un neurone. Entrambe le cellule usano la membrana cellulare per regolare il movimento degli ioni tra il fluido extracellulare e il citosol.

Membrana cellulare e proteine transmembrana. La membrana cellulare è composta da un doppio strato di fosfolipidi e ha molte proteine canale che fungono da canali ionici.

La membrana cellulare è la principale responsabile della regolazione di ciò che può attraversare la membrana e ciò che rimane solo da un lato. La membrana cellulare è un doppio strato di fosfolipidi, quindi solo le sostanze che possono passare direttamente attraverso il nucleo idrofobo possono diffondersi senza aiuto. Le particelle cariche, che sono idrofile per definizione, non possono passare attraverso la membrana cellulare senza assistenza. Quest’ultima è fornita da un “canale ionico”.

Un canale ionico è un gruppo di proteine che formano un poro attraverso il doppio strato lipidico di una cellula. Ogni canale è permeabile a uno ione specifico (ad esempio: potassio, sodio, calcio, cloruro). La tecnica del patch-clamp viene usata per valutare la corrente o la tensione nella membrana associata all’attività del canale ionico tramite misurazione diretta in tempo reale con amplificatori ultrasensibili, sistemi di acquisizione dati di alta qualità e potenti software per valutare i risultati.

Il tipico potenziale d’azione di un singolo neurone, che si produce grazie all’azione dei canali ionici che attraversano la membrana cellulare.

I canali ionici sono coinvolti in molti percorsi cellulari e comprendere la funzione dei canali ionici in risposta ai cambiamenti nel potenziale di membrana o la presenza o l’assenza di altre molecole è importante per capire esattamente come i canali ionici partecipano ai processi biologici normali e anormali come la differenziazione e migrazione delle cellule, stati patologici e comunicazioni neuronali. Essi, fra l’altro, possono venire influenzati dal forte inquinamento elettromagnetico a radiofrequenza.

Le membrane di tutte le cellule nervose hanno una differenza di potenziale tra loro, con l’interno della cellula negativo rispetto all’esterno (figura “a”). Nei neuroni, gli stimoli possono alterare questa differenza di potenziale aprendo i canali del sodio nella membrana. Ad es. i neurotrasmettitori interagiscono con i canali (o gate) del sodio. Quindi gli ioni sodio scorrono nella cellula, riducendo la tensione attraverso la membrana. Una volta che la differenza potenziale raggiunge una tensione di soglia, la tensione ridotta provoca l’apertura rapida di centinaia di gate del sodio in quella regione della membrana.

Il potenziale elettrico fra i due lati di una membrana e l’attivazione del “potenziale di azione”. 

Gli ioni sodio si riversano così nella cellula, depolarizzando completamente la membrana (b). Ciò apre più canali ionici dipendenti dalla tensione nella membrana adiacente, e quindi un’ondata di depolarizzazione percorre la cellula: il cosiddetto “potenziale d’azione”. Quando il potenziale d’azione si avvicina al suo picco, le porte del sodio si chiudono e le porte del potassio si aprono, consentendo agli ioni di fluire fuori dalla cellula per ripristinare il normale potenziale della membrana (c).

La tecnica del patch-clamping e le sue varie applicazioni

Il patch-clamping, una delle tecniche di elettrofisiologia più utilizzate, è lo strumento migliore per studiare l’attività dei canali ionici, che sono i principali obiettivi per i ricercatori a causa del ruolo chiave svolto in molte malattie neurologiche e cardiovascolari, e della loro funzione fisiologica. La tecnica di registrazione del potenziale di campo extracellulare può essere usata per studiare l’attività sinaptica di una popolazione di neuroni e può aiutarci a capire come le informazioni vengono elaborate nel cervello.

Diagramma mostrante le possibili varianti della tecnica patch clamp.

Due studiosi tedeschi, Erwin Neher e Bert Sakmann, hanno sviluppato il patch clamp alla fine degli anni ’70 e all’inizio degli anni ’80. Questa scoperta ha permesso di registrare per la prima volta le correnti delle molecole dei singoli canali ionici, migliorando la comprensione del coinvolgimento dei canali nei processi cellulari fondamentali come potenziali d’azione e attività nervosa. Neher e Sakmann hanno ricevuto il Premio Nobel per la fisiologia o la medicina nel 1991 per questo lavoro.

Con questa tecnica è quindi possibile analizzare le modalità attraverso le quali i canali ionici influiscono sia sulla differenza di potenziale a livello di membrana sia su processi cellulari come la secrezione e la contrazione. Il patch clamp si può utilizzare su colture cellulari, su singole cellule viventi isolate o anche su sottili fettine di tessuto cerebrale o aree (patch) di membrana cellulare. La tecnica è assai utile nello studio di cellule eccitabili come neuroni, cardiomiociti, fibre muscolari e cellule beta del pancreas.

Cellule neuronali dell’ippocampo. La micropipetta usata per il patch-clamp (a cellula intera) è stata evidenziata con la colorazione blu.

In pratica, la si applica utilizzando un solo microelettrodo, costituito da una micropipetta di vetro, la cui estremità ha un diametro di 1 micrometro e una resistenza di 1-10 MegaOhm. Essa viene fatta aderire perfettamente a una membrana cellulare, permettendo così di isolare una piccola area della membrana stessa e i canali ionici in essa presenti. A questo punto è possibile modificare e manipolare chimicamente o elettricamente i canali stessi in modo da studiarne le relative proprietà.

In pratica, nel patch-clamping, la micropipetta – o pipetta patch – è riempita con una soluzione elettrolitica, e un elettrodo di registrazione collegato ad un amplificatore viene messo in contatto con la membrana di una cellula isolata. Un altro elettrodo viene inserito in un bagno che circonda la cellula o il tessuto come elettrodo di massa di riferimento. Un circuito elettrico può essere formato tra l’elettrodo di registrazione e di riferimento con la cella di interesse in mezzo.

Attrezzatura tipica utilizzata durante la registrazione classica di patch clamp.

Lo stato elettrico della membrana cellulare può avere diverse varianti. Queste sono tutte variazioni del potenziale di membrana. Un potenziale è una distribuzione della carica attraverso la membrana cellulare, misurata in millivolt (mV). Lo standard è di confrontare l’interno della cellula rispetto all’esterno, quindi il potenziale di membrana è un valore che rappresenta la carica sul lato intracellulare della membrana in base al fatto che l’esterno è zero, relativamente parlando.

La tecnica del patch clamp può essere utilizzata per indagare le varie tipologie trasmissive tra le cellule e ha consentito di individuare il potenziale non solamente degli assoni di cellule di grandi dimensioni, già rilevate dalle tecniche tradizionali di voltage clamp, bensì quelle di tutti i mammiferi, compreso l’uomo. Nella tecnica definita registrazione della cellula intera (whole-cell), è possibile ottenere un inserimento nel citoplasma, grazie all’asportazione del lembo della membrana nel punto del lume della pipetta.

Misurazione della carica attraverso una membrana con un voltmetro. Un elettrodo di registrazione viene inserito nella cella e un elettrodo di riferimento si trova all’esterno della cella. Confrontando la carica misurata da questi due elettrodi, viene determinata la tensione transmembrana. È convenzionale esprimere quel valore per il citosol rispetto all’esterno.

La soluzione che riempie l’affilata pipetta patch potrebbe corrispondere alla composizione ionica della soluzione da bagno, come nel caso della registrazione collegata alle cellule, oppure corrispondere al citoplasma, per la registrazione di cellule intere. La soluzione nella soluzione da bagno, invece, può corrispondere alla soluzione extracellulare fisiologica, al citoplasma o essere del tutto non fisiologica, a seconda dell’esperimento che si intende eseguire.

Molti amplificatori di patch clamp non utilizzano veri circuiti di voltage clamp, ma sono invece amplificatori differenziali che utilizzano l’elettrodo da bagno per impostare il livello di corrente zero (terra). Ciò consente a un ricercatore di mantenere costante la tensione osservando i cambiamenti di corrente. Per effettuare queste registrazioni, la pipetta patch viene confrontata con l’elettrodo di massa. La corrente viene quindi iniettata nel sistema per mantenere costante la tensione impostata.

La corrente necessaria per bloccare la tensione è, in questo caso, di segno opposto e uguale in grandezza alla corrente attraverso la membrana. In alternativa, la cellula può essere bloccata in corrente in modalità a cellula intera, mantenendo costante la corrente osservando le variazioni della tensione della membrana. Per tali tipi di esperimenti, dunque, risultano fondamentali gli alimentatori stabilizzati con regolazione (grossolana e fine) di tensione e di corrente, come quelli che puoi trovare ad es. qui.

Misurazione del potenziale di membrana a riposo. Le differenze di potenziale fra gli elettrodi di registrazione e di riferimento sono amplificate da un amplificatore di tensione e mostrate su un voltmetro, un oscilloscopio o un monitor del computer.

Come si effettua il patch-clamp in pratica: un’introduzione

Un potenziale problema con la tecnica del patch clamp è che un dispositivo deve essere fisicamente attaccato al neurone da misurare. Connettere qualsiasi cosa a un neurone potrebbe alterarne il comportamento. Lo stesso dispositivo di misurazione può distorcere il segnale. Questo problema di caricamento (loading) del sistema da misurare influisce su molti tipi di misurazioni (non soltanto su quelle elettroniche). Vediamo di approfondirlo un attimo.

Si possono misurare i picchi elettrici prodotti da un neurone (chiamati potenziali d’azione) collegando l’apparato di patch clamp a un oscilloscopio con un cavo che ha una capacità di 80 pFd. I potenziali d’azione tipicamente sono circa 100 mV di ampiezza e circa 1 ms di durata. Per come si misurano in pratica i potenziali d’azione e come si possono fare interessanti esperimenti su di essi, vedi il ns. articolo Come misurare il potenziale d’azione dei neuroni, che trovi qui.

Schema elettrico che descrive il circuito di misura del potenziale d’azione, costituito dal neurone, da due elettrodi e (in questo caso) da un oscilloscopio. Lo schema mostra l’impedenza del neurone e l’impedenza di ingresso dell’oscilloscopio.

Un modello circuitale per un neurone collegato ad un apparato di patch clamp è costituito da una sorgente di tensione variabile nel tempo in serie con un’impedenza di uscita di 1011 Ω (ovvero 100 GΩ). L’oscilloscopio è posto vicino al neurone e ha un’impedenza di ingresso di circa 106 Ω e una capacità di ingresso di 20 pFd. È possibile modellare il rumore nell’oscilloscopio come una tensione casuale, additiva, normalmente distribuita con una deviazione standard di 10-3 V.

Il segnale di corrente o tensione all’uscita dell’amplificatore del patch-clamp è un segnale analogico ma, per eseguire l’analisi dei dati necessaria per le misure di patch-clamp ad alta risoluzione, il segnale analogico deve essere convertito in uno digitale. Posizionato tra l’amplificatore e il computer, il digitalizzatore svolge questo importante compito. La qualità del segnale è estremamente importante ed è influenzata dalla frequenza di campionamento: l’ultima generazione di digitalizzatori campiona a 500 kHz.

Il patch-clamping può essere eseguito utilizzando la tecnica del voltage-clamp. In questo caso, la tensione attraverso la membrana cellulare è controllata dallo sperimentatore e vengono registrate le correnti risultanti. In alternativa, è possibile utilizzare la tecnica di bloccaggio di corrente (current-clamp). In questo caso, la corrente che passa attraverso la membrana è controllata dallo sperimentatore e le conseguenti variazioni di tensione sono registrate, generalmente sotto forma di potenziali di azione.

Il voltage clump utilizza un meccanismo di feedback negativo. L’amplificatore del potenziale della membrana misura la tensione della membrana e invia l’uscita all’amplificatore di feedback. L’amplificatore di feedback sottrae la tensione di membrana dalla tensione di comando, che riceve dal generatore di segnali. Questo segnale viene amplificato e restituito nella cella tramite l’elettrodo di registrazione.

Il current-clamp , invece, è un metodo usato per misurare il potenziale di membrana (tensione) risultante da una iniezione di corrente. Per misurare tale potenziale, si monitora la caduta di tensione avviata dall’iniezione di corrente lungo una resistenza in serie. Una pinza amperometrica è usata per iniettare forme d’onda di corrente simulate ma realistiche in una cellula e per monitorare l’effetto della membrana. Questa tecnica è ideale anche per valutare importanti eventi cellulari come i potenziali d’azione.

Una registrazione di patch clamp di corrente rivela le transizioni tra due stati di conduttanza di un singolo canale ionico: chiuso (in alto) e aperto (in basso).