Come fare l’elettroforesi di varie sostanze

L’elettroforesi, che significa “trasporto per via elettrica”, è una tecnica che permette la separazione di sostanze combinate intimamente, ed in particolare il frazionamento delle miscele molecolari. Con un semplice apparato di cui mostreremo la realizzazione, e che sfrutta la diversa velocità di migrazione di particelle differenti poste in un campo elettrico, è possibile analizzare e separare campioni organici o inorganici (ad es. il sangue). Così scoprirete anche come la polizia scientifica in passato poteva stabilire se due sostanze simili (ad es. due inchiostri blu) erano davvero uguali.

Alla base di questa tecnica, vi è il fatto che gran parte delle sospensioni di molecole in acqua subiscono una polarizzazione, per cui sono in grado di condurre della corrente. Anche delle molecole che di norma non sono in grado di condurre corrente, né di assumere una carica, presentano la tendenza ad assorbire ioni dall’acqua. Talune molecole  riescono ad assumere una carica maggiore di altre in funzione della loro natura chimica e della concentrazione degli ioni presenti nella soluzione.

Se la concentrazione ionica – ovvero il cosiddetto pH – è regolato opportunamente, tutte le molecole che risultino in una qualche stretta correlazione chimica (come ad es. le cellule del sangue umano) presentano una tendenza ad assorbire cariche dello stesso segno. Di conseguenza, quando esse sono sottoposte a un campo elettrico, tendono a migrare nella stessa direzione, sebbene in quantità variabili in funzione del livello della carica di ciascuno dei membri della famiglia.

Pertanto, se una differenza di potenziale viene applicata a una goccia di liquido contenente, ad esempio, delle cellule del sangue in sospensione, le cellule stesse tendono a migrare in direzione di uno o dell’altro degli elettrodi tramite i quali il campo elettrico viene applicato.

Se si generalizza il discorso a una miscela, quel che succede è che, quando viene applicata la differenza di potenziale al liquido che contiene la miscela in sospensione, alcuni elementi della miscela migrano verso uno degli elettrodi, mentre altri possono migrare in direzione dell’altro. Ed anche le varie sostanze che migrano nella stessa direzione, lo fanno a velocità diverse e caratteristiche. In questo modo, le varie sostanze vengono rese visibili. Donde l’utilità dell’elettroforesi.

Un semplice apparato per l’elettroforesi

Esiste un metodo non raffinatissimo, ma assai efficiente, per realizzare l’elettroforesi che ho adottato nel mio laboratorio Sbalordiscienza e che in questo articolo illustrerò. Esso si basa sull’impiego, come supporto solido poroso, della semplice carta igienica.

L’apparato che realizzeremo sfrutta la quantità di carica elettrica, ed il segno di questa, trasportabile dalla sostanza in analisi. L’entità ed il segno della carica assunta dalle varie sostanze in soluzione o in sospensione dipende dalla natura chimica delle sostanze stesse e dal pH, ossia dall’equilibrio di acidità e alcalinità  presentato dalla sostanza che serve da solvente (e che possiamo misurare facilmente con le cartine al tornasole o con un pH-metro del costo di pochi euro acquistabile online).

Un kit per la misurazione del pH compredente un pH-metro elettronico (a sinistra) e le classiche cartine al tornasole per una stima più grossolana del pH (a destra).

Le molecole di sostanze in grado di trasportare di norma una leggera carica elettrica – come, ad esempio, le proteine a reazione leggermente basica – sono molto sensibili alla variazione del pH: una piccola variazione nella basicità o nell’acidità della soluzione può indurre una sensibile variazione nel regime con cui le particelle trasmigrano, e può anzi dar luogo addirittura a un’inversione della loro direzione di spostamento.

Per attuare la tecnica dell’elettroforesi, occorre quindi scegliere degli elettroliti – ovvero sorgenti di ioni – che presentino un’azione di “tamponamento”, ossia che tendano a fornire quantitativi di ioni negativi e positivi ad un regime di produzione in grado di sostituire con esattezza quelli che vengono via via rimossi o dissipati dalla soluzione stessa. Molti sali comuni presentano un’efficiente attività di tamponamento, ma il comune sale da cucina (o cloruro di sodio) non si presta molto.

Il materiale occorrente per realizzare la nostra prima elettroforesi è pertanto il seguente:

  • Carta igienica (o della carta assorbente o bibula)
  • Due elettrodi di carbone (ad es. la mina spessa per matite)
  • Due vetrini portaoggetto per microscopia
  • 4 mollette di plastica per il bucato (dello stesso colore)
  • 2 vaschette basse con apertura larga non conduttrici
  • 6 pile da 9 V (e relativi morsetti volanti)
  • Sale da cucina (cloruro di sodio)
  • Bicarbonato di sodio

Le estremità della striscia di carta igienica si immergono in due vaschette terminali contenenti la soluzione elettrolitica nella quale sono immersi i due elettrodi di carbone, la cui funzione è quella di trasportare nel sistema la tensione continua di alimentazione e di eccitazione.

Un semplice apparato per l’elettroforesi che usa dei vetrini per microscopia.

I fenomeni interessati alle tecniche dell’elettroforesi possono essere dimostrati con la maggior parte dei tipi di carta non caricata: ottime, ad esempio – oltre alla carta igienica – la carta assorbente bianca, di tovagliolini di carta e di cellulosa. In ogni caso, occorre che si tratti di carta non collata e senza scrittura e stampe. Inoltre, dove si vogliano ottenere dei grafici di analisi, occorrerà fare uso di una carta speciale, di composizione uniforme ed esente da contaminazioni estranee.

Per ritardare la velocità di evaporazione del liquido dalla estesa superficie della carta igienica, una sua striscia viene fatta passare nello spazio compreso fra due vetrini portaoggetto per microscopia sovrapposti. Allo scopo di mantenere uniforme il fenomeno di migrazione lungo la striscia, è utile mantenere questa sotto una pressione praticamente costante in tutti i suoi punti, dal che si può ottenere anche una più regolare distribuzione delle varie sostanze trasportate per effetto elettroforetico.

Una certa pressione, inoltre, ha anche il merito di ridurre la quantità di acqua presente lungo la zona, dal che deriva una ulteriore uniformità della distribuzione dei vari elementi della sostanza analizzata. Bisogna comunque dire che, se tale pressione è troppo elevata, tende a determinare delle leggere torsioni nelle lastre di vetro ed a distorcere, analogamente, le zone di distribuzione. Si può risolvere il problema usando 2 o 4 mollette da bucato per stringere le estremità dei due vetrini.

Contenitori di qualsiasi forma e misura, purché di preferenza bassi, con apertura larga, possono essere usati per accogliere come in figura il liquido che rappresenta la soluzione tampone, realizzato sciogliendo del sale nell’acqua, come per l’elettrolisi. Ottime, a questo proposito, sono le vaschette di pyrex.

In ogni caso, le tre condizioni che i contenitori devono soddisfare sono: che presentino un’assoluta inerzia chimica alle sostanze della soluzione tampone, come anche  a quelle della miscela da analizzare; inoltre, la presenza del contenitore non deve in alcun modo disturbare la migrazione delle particelle in analisi, come invece potrebbe accadere nel caso in cui i contenitori fossero in metallo o di un’altra sostanza conduttrice; infine, devono essere abbastanza pesanti da sostenere il peso che li sovrasterà.

La parte elettrica: elettrodi e alimentatore

L’inerzia chimica deve essere un elemento da tenere in grande importanza anche quando si tratta di provvedere alla scelta degli elettrodi da usare per portare la corrente di alimentazione al sistema di elettroforesi. Molti professionisti usano elettrodi di platino, mentre anche elettrodi di carbone di storta prelevati da pile – o mine larghe non ricoperte, composte da grafite – possono andare abbastanza bene. Sono invece da evitare elettrodi metallici (fuorché i costosi metalli nobili).

La corrente continua richiesta per l’esecuzione dell’elettroforesi varia in funzione della sostanza che si deve analizzare e del pH della soluzione. Un alimentatore con trasformatore e stadio raddrizzatore in gradi di erogare una tensione fra 50 V e – massimo! – 100 V in continua (DC), con una corrente di alcune decine di milliampere, può essere sufficiente per la maggior parte degli esperimenti con quest’apparato. Una descrizione di questo tipo di alimentatore, rivolta solo a persone adulte e responsabili, la trovate qui, nell’articolo “Un alimentatore per tensioni intermedie”. I ragazzi potranno usare invece, come alimentazione, 6 pile da 9 V in serie, ottenendo una tensione di 6 x 9 = 54 V.

Un esempio di semplice alimentatore che sfrutta un trasformatore con uscita a 110 V. Leggi qui l’articolo sugli alimentatori per tensioni intermedie per le nozioni di base sulla sicurezza.

Assieme alla tensione continua erogata, è utile avere, collegato ai capi degli elettrodi, anche un dispositivo – ad es. un voltmetro in continua o un multimetro – che fornisca un’indicazione continua della tensione presente, allo scopo di poter mantenere il voltaggio costante ove si verifichino delle variazioni di carico in funzione della variazione dello stato elettrolitico della soluzione. È utile avere anche un milliamperometro o un multimetro in serie ad uno dei due elettrodi per misurare la corrente.

Esistono in commercio degli alimentatori appositi, realizzati con dispositivi per la stabilizzazione automatica o semi-automatica della corrente erogata; ad ogni modo, una tale soluzione non è indispensabile e la spesa che un acquisto di tale complesso comporta può essere evitata. Anche un potenziometro a filo, in grado di dissipare una potenza di 10 W, e collegato ai capi dell’uscita dell’alimentatore per realizzare un partitore di tensione e poter variare la tensione da zero al massimo, non è indispensabile.

In ogni caso, durante l’impiego di apparecchiature di questo genere – o dell’alimentatore auto-costruito – occorre dedicare una notevole attenzione allo scopo di evitare qualche scossa che risulterebbe pericolosa appunto per il non trascurabile voltaggio presente (non toccate MAI terminali con tensioni in corrente alternata superiori a 50 V AC e in corrente continua superiori a 120 V DC!) e per la presenza di acqua.

Esecuzione di un’elettroforesi esemplare

Come elettrolita per i nostri primi esperimenti, conviene usare una debole soluzione di comune sale da cucina, con l’aggiunta di un piccolo quantitativo di bicarbonato di sodio, nella funzione di sostanza tampone. In seguito, sarà possibile sperimentare altre sostanze che, oltre ad adempiere alla funzione di elettrolita, presentino la capacità di servire da tampone.

La separazione delle sostanze coloranti artificiali può essere un’interessante esperienza per la nostra prima elettroforesi. Esse sono infatti talvolta addizionate per migliorare l’aspetto di vini inferiori e di quelli artificiali. Una miscela sperimentale in tal senso può essere preparata aggiungendo pochissime gocce di un colorante alimentare ad un certo quantitativo di spuma o di bevanda simile.

Una delle due macchie di colorante blu comincia subito a migrare. (fonte: Sbalordiscienza)

I coloranti per uso alimentare tendono a migrare in un campo elettrico (V) di 1 V/mm di distanza sotto una corrente (I) di una decina di milliampere, occupando delle zone diverse in una gradevole disposizione. Dalle condizioni in cui avviene l’operazione, dal punto di vista elettrico, la carta inumidita dovrebbe presentare una resistenza elettrica (R) di circa 1000 Ohm/cm di lunghezza. Infatti, per la prima legge di Ohm, R = V / I = 1000 (V/m) / 0,01 (mA) = 100000 Ohm/m = 1000 Ohm/cm.

Per ottenere questi valori di resistenza, potrà essere necessario sperimentare su un elettrolita preso in varie proporzioni di diluzione. Si comincia pertanto a versare nelle due bacinelle un quantitativo di acqua sufficiente per portare il livello del liquido a 10 o 15 millimetri dall’orlo dei recipienti stessi. Poi si versa questa quantità di acqua in un unico recipiente di vetro e ad essa si aggiunge un cucchiaino raso di sale da cucina (eventualmente pesandolo prima per determinare il peso del sale).

Quando questa sostanza si è perfettamente disciolta, si immerge nella soluzione la striscia di carta destinata a servire da supporto poroso. Subito dopo si toglie la striscia di carta, se ne elimina l’umidità in eccesso inserendola per pochi secondi tra due fogli di carta assorbente pulita e di sufficiente grandezza ed infine la si inserisce fra le due piastrine di vetro, curando che un’uguale porzione di essa sporga dalle due estremità, e possa quindi andare a pescare nel liquido che verseremo poi nelle bacinelle.

Si serrano infine, in un tutto unico, le due piastrine di vetro applicando in prossimità dei quattro angoli delle pinzette di plastica per il bucato. Si versa allora la soluzione salina, in parti uguali, nei due contenitori, si lascia cadere sull’orlo di questi gli estremi della striscia di carta già inserita fra le lastrine di vetro e ci si accerta che le estremità inferiori della striscia stessa peschino per un tratto quasi uguale nel rispettivo recipiente, quindi si collega il sistema all’alimentatore.

Predisposte così le cose, si dà tensione al complesso. Se la corrente risultante è inferiore a 10 milliampere,occorre staccare l’alimentazione, estrarre la striscia dalla coppia di lastrine di vetro, riportare la soluzione delle due bacinelle in un unico recipiente dove si aggiunge altro sale da cucina, allo scopo di aumentare lo stato di ionizzazione e quindi conducibilità del liquido, dopodiché si prova di nuovo sotto tensione. E così via, finché non si raggiunge la corrente minima desiderata.

Di solito, occorre un cucchiaino raso da caffè di sale per 300 millilitri di acqua distillata per ottenere condizioni ideali di conducibilità, ma le condizioni possono variare alquanto se si usa acqua non distillata – ad esempio, del rubinetto – per la presenza di altre sostanze, ionizzanti o meno. La sostanza destinata a servire da “tampone”, rappresentata da ¼ di cucchiaino da caffè di bicarbonato di sodio per 300 ml di acqua, non introduce alcuna variazione nelle condizioni di funzionamento del sistema.

Una volta che sia stato ottenuto un elettrolita avente una resistenza elettrica appropriata, prima di serrare i vetrini con le pinzette si applica, con la punta di uno stuzzicadenti, una piccola gocciolina della sostanza che interessa analizzare, ossia – in questo caso – della spuma addizionata con le tracce di colorante artificiale.  Ma prima di ricoprire con l’altro vetrino e di immergere le due estremità libere della striscia di carta nelle due vaschette e dare corrente al sistema, la macchia va fatta un po’ essiccare.

Ioni stazionari (a) e in movimento sotto l’effetto di un campo elettrico (b) nell’elettroforesi.

In pratica, si fa evaporare parzialmente la macchia, lasciando la striscia di carta esposta alla temperatura ambiente in un locale esente da polvere e finché la quantità di liquido presente non si sarà ridotta alla metà di quella originaria. Ove possibile, comunque, sarà bene fare in modo di protrarre al massimo l’essiccazione dell’umidità contenuta nella macchia, poiché più spinta sarà stata questa essiccazione e più netta e nitida sarà la macchia di colore nella successiva elettroforesi.

Meglio ancora se una prima essiccazione sia fatta inserendo prima la striscia di carta fra due fogli di carta assorbente e quindi inserendo il tutto fra le piastrine di vetro. In ogni caso, l’essiccazione potrà considerarsi sufficiente quando una mano, pulitissima, passata sulla macchia di colore non determina alcuno scorrimento della sostanza colorante né alcuna perdita della forma originaria.

Risultati e possibili variazioni sul tema

Se il campione della bevanda in esame contiene qualche sostanza colorante artificiale, anche se innocua, dopo circa 5 minuti di circolazione di corrente, il bordo della macchia di vino o altra bevanda rivolto verso la vaschetta nella quale si trova l’anodo del circuito (cioè collegato al polo positivo dell’alimentatore) tenderà a divenire molto più netto e deciso, mentre quello rivolto verso il catodo (cioè collegato al polo negativo o terra dell’alimentatore) perderà molto della sua definizione.

Entro un’ora, una macchia di colore – probabilmente di forma allungata, simile a una cometa – si sarà spostata di un buon tratto dal punto in cui essa era in origine. Con il continuare del trattamento, altre macchie di colore, per lo più allungate e ciascuna prodotta da uno dei componenti della sostanza colorante, scorreranno lungo la carta, su una linea corrispondente all’asse della prima macchia. La sostanza colorante svilupperà questa linea in circa 6 ore, mentre la macchia originale si muoverà assai meno.

Distribuendo campioni di varie bevande lungo l’asse perpendicolare alla lunghezza della striscia di carta è possibile eseguire confronti fra diverse qualità di sostanze analoghe, come appunto nel caso dei vini e di altri prodotti suscettibili di adulterazione o di falsificazione. In più sarà anche possibile eseguire delle analisi multiple. Anche la ricerca delle caratteristiche di mobilità delle varie sostanze (misurando i tempi dei rispettivi spostamenti è un campo di ricerca interessante per i primi esperimenti.

Possiamo inoltre determinare l’effetto dei vari livelli di sale su corrente, resistenza della soluzione e campo elettrico in V/m. Quest’ultimo si può misurare ponendo i due puntali di un tester alle estremità della striscia (a vetrino sollevato per non rovinarla) e misurando la tensione in V, da dividere poi per la lunghezza in mm del vetrino). Potremo così fare una tabella con i seguenti parametri chiave: Sale (mg) – Tampone (mg) – Tensione (V) – Corrente (A) – Resistenza (ohm) – Campo elettrico (V/mm).

I dilettanti che desiderano affrontare qualche esperienza più impegnativa possono provare ad operare la separazione delle proteine presenti nel proprio sangue. Sarà però necessario usare una centrifuga per separare preliminarmente il siero, o plasma, dal tessuto sanguigno. Inoltre, occorre conoscere le tecniche di colorazione per rendere visibile direttamente l’elettroforesi ottenuta. Quest’argomento, però, va al di là dei nostri obiettivi, quindi rimandiamo il lettore a ricerche personali sul tema.

Infine, per chi vuole un’esperienza ultra-semplificata e veloce che dia solo il “sapore” dell’elettroforesi, suggerisco quella dimostrativa che uso nel mio laboratorio Sbalordiscienza. In pratica, come soluzione tampone uso solo il sale da cucina, mentre sulla striscia di carta pongo due “macchie” di uguali dimensioni: una fatta con uno stuzzicadenti in precedenza intinto in un flacone di blu di metilene per microscopia; l’altra fatta poggiando appena la punta di un pennarello blu di quelli grandi e indelebili.

Preparazione dell’elettroforesi comparativa di due coloranti blu diversi.

Inoltre, non vi è essicazione della striscia, bensì subito la copro con l’altro vetrino coprioggetto. Né vi è imbibizione preliminare della striscia, poiché sfrutto quella per capillarità che avviene da sola nel giro di un po’ di tempo, una volta che i bordi della striscia serrata con le pinzette fra i vetrini siano immersi nell’acqua delle due bacinelle. Una volta che la striscia si sia bagnata per capillarità, dò corrente al sistema e, nel giro di un’oretta, lo spostamento a velocità differente dei due coloranti risulta evidente.

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