Come fare cromatografia su colonna

La cromatografia su colonna è una tecnica di purificazione comunemente usata nei laboratori di tutto il mondo. Fatta bene, può semplicemente e rapidamente isolare i composti desiderati da una miscela. Ma come molti aspetti della chimica pratica, la rapida ed efficiente installazione e gestione di una colonna è qualcosa che può richiedere mesi per padroneggiarla. Qui forniamo alcuni suggerimenti e trucchi per l’esecuzione di una colonna, la risoluzione di alcuni problemi comunemente riscontrati durante la cromatografia su colonna e alcune alternative “rapide e sporche” a una colonna intera.

La cromatografia è una tecnica di laboratorio per la separazione di una miscela, inventata all’inizio del secolo scorso in Russia dallo scienziato italiano Mikhail Tsvet. La miscela viene dissolta in un fluido chiamato fase mobile, che lo trasporta attraverso una struttura che contiene un altro materiale chiamato fase stazionaria. I vari componenti della miscela viaggiano a velocità diverse, facendoli separare. La separazione si basa sul partizionamento differenziale tra le fasi mobile e stazionaria.

La cromatografia su colonna è una tecnica di separazione in cui il letto fisso si trova all’interno di un tubo collocato verticalmente. Le particelle della fase stazionaria solida o il supporto rivestito con una fase stazionaria liquida possono riempire l’intero volume interno del tubo (colonna impaccata) o concentrarsi sulla parete interna del tubo o lungo tale parete lasciando un percorso aperto e senza restrizioni per la fase mobile nella parte centrale del tubo (colonna tubolare aperta).

Schema di funzionamento della cromatografia a colonna.

La cromatografia può essere preparativa o analitica. Lo scopo della cromatografia preparativa è di separare i componenti di una miscela per un uso successivo ed è quindi una forma di purificazione. La cromatografia analitica viene eseguita normalmente con quantità minori di materiale ed è per stabilire la presenza o misurare le proporzioni relative degli analiti in una miscela. Le due cose non si escludono a vicenda, come ad es. nella cromatografia su colonna, di cui illustreremo qui l’uso purificativo.

Le colonne cromatografiche sono generalmente utilizzate nei laboratori di chimica organica e inorganica di tutto il mondo per rimuovere il materiale di partenza che non ha reagito o isolare un prodotto desiderato da una gamma di sottoprodotti dopo che è stata eseguita una reazione. Per fare ciò, il campione misto viene fatto passare in un tubo di vetro verticale impacchettato con silice o allumina e raccolto in piccole porzioni, o frazioni, alla fine, come vedremo in questo articolo.

I vari componenti del campione vengono separati nei loro diversi tipi di composti attraverso l’interazione con il solvente (o sistema di solventi) e la silice. I composti polari interagiranno con la silice più fortemente di quelli non polari, quindi usciranno dalla colonna o eluiranno dopo i composti non polari. Quando un campione contiene composti con polarità simile, la separazione tra di essi allora può essere piccola e recuperare tutto il campione pulito può diventare una sfida.

Preparazione: “impacchettare” una colonna

In una colonna tipica (v. la figura), la fase stazionaria, un adsorbente solido che è normalmente gel di silice (SiO2) oppure allumina (Al2O3), viene collocato in una colonna di vetro posta in verticale. La fase mobile, costituita da un liquido, viene aggiunta nella parte superiore della colonna e scorre attraverso la colonna per gravità (o per pressione esterna, nella cromatografia “flash”). La separazione dei composti si ottiene attraverso l’assorbimento variabile e l’interazione tra le fasi stazionaria e mobile.

Il setup generale di una colonna per cromatografia.

Alcune colonne hanno delle cosiddette “fritte” di vetro (vedi la figura qui sotto) per impedire la perdita della fase stazionaria dal fondo; altre no e dovranno essere collegate con lana di vetro o cotone idrofilo. Quale usi è una preferenza personale. Posizionare il cotone o la lana di vetro all’inizio può essere scomodo, ma le fritte di vetro sono più difficili da pulire e possono essere una fonte di impurità, come la silice che perde attraverso la fritta nelle frazioni raccolte.

Colonne con fritta (a sinistra) e senza fritta (a destra).

Ciò può essere evitato aggiungendo uno strato di sabbia tra la fritta e la silice. Anche la porosità delle fritte può variare. Ciò significa che la velocità del flusso di solvente può essere diversa per colonne diverse. Le fritte molto porose perderanno più silice, ma le fritte meno porose hanno portate più lente – a volte troppo lente – e possono portare all’accumulo di pressione nella cromatografia flash.

Colonna con fritta

  • Trova una colonna pulita e vuota di dimensioni adeguate.
  • Blocca saldamente la colonna e chiudere il rubinetto o il tappo.
  • Aggiungi uno strato di sabbia (circa 0,5 cm, opzionale).

Colonna senza fritta

Un gomitolo di cotone o lana di vetro dovrebbe essere abbastanza grande da tappare il fondo della colonna, ma non così grande e densamente impacchettato da limitare il flusso di solvente. Un pezzo delle dimensioni della punta del mignolo dovrebbe essere adatto per la maggior parte delle colonne.

Linee guida per la dimensione corretta di cotone o lana di vetro e sabbia per colonne senza fritta.

Esistono diversi metodi per riempire, a questo punto, la propria colonna per cromatografia. Puoi trovare un metodo più facile o più veloce degli altri e riempire sempre una colonna in quel modo, oppure potresti scoprire che colonne di dimensioni diverse richiedono metodi diversi. Tutti i metodi hanno i loro pro e contro e potresti doverli provare tutti per trovare quello che preferisci. Qui illustreremo il semplice impacchettamento a secco, per il quale avrai bisogno delle seguenti cose:

  • Colonna preparata come illustrato sopra
  • Imbuto adatto per solidi secchi
  • Qualcosa con cui tappare la colonna
  • Solvente
  • Silice o allumina

Ecco la procedura da seguire per l’impacchettamento a secco:

  1. Riempi la colonna con solvente, lasciando che un po’ attraversi la sabbia e il cotone idrofilo per rimuovere le bolle d’aria (Fig. 4, passaggio B).
  2. Posiziona un imbuto secco nella parte superiore e versa delicatamente la silice o l’allumina (fase stazionaria) nel solvente. Consenti al solvente di drenare per evitare il trabocco (Fig. 4, passaggio C).
  3. Lascia che la fase stazionaria si stabilizzi e picchietta delicatamente la colonna (vedi riquadro sotto) in modo che la silice o l’allumina si impacchettino saldamente nella colonna (Fig. 4, fase D).
  4. Scarica il solvente fino a quando il livello del solvente è pari alla superficie della fase (Fig. 3, passaggio E).

Il metodo dell’impacchettamento a secco della colonna.

Scelta del sistema di solventi e della quantità di silice

Quella dei solventi è la scelta più difficile da fare e la più importante. In ogni laboratorio di chimica organica è possibile scegliere tra una vasta gamma di solventi. Quindi, da dove iniziare? La cromatografia su colonna – in particolare la cromatografia “flash”, di cui non ci occuperemo – viene normalmente eseguita con una miscela di due solventi come fase mobile: una polare, una non polare. Occasionalmente, è possibile utilizzare un singolo solvente o è necessaria una miscela di tre solventi.

Molte persone hanno i loro sistemi di solventi preferiti e inizieranno automaticamente con questi e regoleranno il mix secondo necessità. Solventi comuni e sistemi di solventi sono riportati nella tabella qui sotto. Una delle prime scelte preferite da molte persone è una miscela di esano ed acetato di etile.

Solventi comuni e sistemi di solventi per cromatografia su colonna (e “flash”).

Per ottenere una buona separazione tra il prodotto e le impurità e, laddove possibile, utilizzare meno solvente possibile, la chiave è testare i potenziali sistemi di solventi prima di impostare la colonna. Per fare questo, dovrai eseguire la cromatografia su strato sottile (TLC) – illustrata nel nostro articolo Esperimenti di cromatografia su strato sottile, che trovi qui – usando lastre di vetro o alluminio rivestite di silice (le lastre di alluminio sono più economiche, quindi sono più comuni).

Layout tipico della piastra per cromatografia su strato sottile (TLC) e definizione del valore Rf.

Il risultato finale dovrebbe essere un sistema solvente che sposta il composto target di circa 1/3 del percorso totale del solvente (valore Rf tra 0,25 e 0,35). Si consiglia un sistema solvente che dia un Rf tra 0,25 e 0,35 in quanto dà al campione il tempo di equilibrarsi sulla colonna e quindi essere completamente risolto in tutte le sue parti componenti. Non essere tentato di utilizzare un sistema solvente con un Rf più elevato, specialmente se questo è l’unico sistema solvente che hai testato.

Quando hai trovato un sistema solvente che offre una separazione ragionevole, dovresti prenderti qualche minuto per vedere la forma dei punti. Idealmente, i punti dovrebbero essere rotondi e distinti l’uno dall’altro. I punti con lunghe code su una piastra TLC possono tradursi in bande larghe e possibilmente in composti sovrapposti sulla colonna. Se hai provato diversi sistemi di solvente e non riesci a trovarne uno che dia punti perfettamente rotondi, non preoccuparti.

Infatti, finché la separazione tra i punti è buona, otterrai comunque una buona separazione sulla colonna. Nella situazione 3 in figura, è ancora possibile ottenere un campione pulito del composto superiore, ad esempio per la caratterizzazione, ma si perderà parte del prodotto man mano che si inserisce nella banda seguente sulla colonna cromatografica. Questo non è raccomandato se la resa è importante.

Possibili forme dei punti (spot) su una piastra TLC.

Alcuni sosterrebbero che la scelta del diametro della colonna è il fattore meno importante quando la si sceglie. In effetti, in teoria è possibile utilizzare una colonna molto sottile con una grande lunghezza di silice o una colonna spessa con una lunghezza più corta di silice per avere un pari effetto. Tuttavia, in pratica, la maggior parte delle persone sceglierà una dimensione della colonna che consente loro di riempire la colonna da circa un terzo a mezza piena di silice (escluso il serbatoio del solvente).

La scelta della dimensione della colonna è meno importante della quantità di silice utilizzata.

Ciò, ovviamente, dipende da quanta silice utilizzerai. La quantità di silice necessaria è determinata dalla quantità del campione da separare. Il rapporto tra silice e campione non deve essere esatto, ma dovrebbe trovarsi nell’area giusta per evitare sprechi di tempo e risorse. Si consiglia inoltre di misurare la silice in base al peso piuttosto che al volume, poiché la densità della silice può variare a seconda del tipo.

L’altro fattore che influenza la quantità di silice richiesta è la facilità o la difficoltà della separazione. Ciò viene determinato eseguendo la cromatografia su strato sottile (TLC) – illustrata nel nostro articolo che trovi qui – come parte del processo di scelta di un solvente. Maggiore è la separazione, maggiore sarà il rapporto tra peso di silice e peso del campione. Vedi la tabella qui sotto per delle linee guida.

Linee guida per il rapporto silice-campione a seconda della facilità della separazione da eseguire.

Come caricare e far funzionare una colonna

In precedenza abbiamo esaminato come impacchettare una colonna e come scegliere l’attrezzatura e i solventi necessari. Dopo aver creato la colonna, sarai pronto per caricare e far funzionale la tua colonna. Il caricamento della colonna comporta il posizionamento del campione direttamente sulla parte superiore della colonna e il suo assorbimento sulla silice. Per caricare la colonna occorre:

  1. Sciogliere il campione nella quantità minima di solvente (5-10 gocce). Un solvente polare leggermente più di quello che si utilizzerà per la colonna può essere utilizzato, se questo aiuta con la dissoluzione del campione. Se è necessario utilizzare un solvente come il diclorometano o qualcosa di più forte, potrebbe essere preferibile il metodo di caricamento a secco descritto di seguito.
  2. Usando una pipetta o una siringa con un ago spesso, gocciolare il campione direttamente sulla parte superiore della silice. Cerca di non disturbare la superficie. Idealmente, il campione dovrebbe essere equamente distribuito su tutta la superficie in modo da formare una sottile banda orizzontale.
  3. Dopo aver aggiunto l’intero campione, consenti alla colonna di drenare in modo che il livello del solvente tocchi la parte superiore della silice.
  4. Aggiungi con attenzione uno strato di sabbia (circa 2–5 mm). Ciò contribuirà a evitare che la superficie della silice venga disturbata quando viene aggiunto più solvente.
  5. Utilizza una pipetta per aggiungere altro solvente in modo che il livello del solvente sia circa 10 mm sopra la parte superiore della sabbia.
  6. Lascia scaricare questo solvente fino a quando il livello del solvente è circa 1–2 mm sopra la cima della sabbia.
  7. Ripetere i passaggi 5 e 6 una o due volte in più. Ciò assicurerà che il campione sia assorbito sulla silice.
  8. Infine, aggiungi tutto il solvente necessario. Ora sei pronto per iniziare a far funzionare la tua colonna.

Un esempio di colonna per cromatografia in azione.

Se il composto presenta una scarsa solubilità nel sistema solvente che offre la migliore separazione, è possibile caricare a secco il campione sulla colonna. Per caricare a secco il composto, avrai bisogno di:

  • Pallone a fondo tondo
  • Silice secca
  • Un solvente in cui il campione si dissolve completamente
  • Evaporatore rotante

La procedura da seguire è in tal caso la seguente:

  1. Sciogliere il campione in un solvente appropriato. Trasferirlo in un pallone a fondo tondo se non è già in uno.
  2. Aggiungere la silice secca al campione disciolto (circa 10-20 volte la massa del campione).
  3. Agitare o mescolare delicatamente per assicurarsi che tutta la silice sia sospesa all’interno della soluzione.
  4. Far evaporare delicatamente il solvente usando un evaporatore rotante fino a quando la silice non è asciutta e scorre liberamente. Se è ancora un olio, aggiungi altra silice e ripeti la procedura.
  5. Aggiungi con cura il solvente alla colonna in modo che il livello del solvente sia circa 2-3 cm sopra la parte superiore della silice. Utilizzare una pipetta per assicurarsi che la superficie della silice non sia disturbata.
  6. Versa la silice secca che è satura del campione nella colonna e lascia che si depositi. Assicurarsi che il livello del solvente rimanga sempre sopra la parte superiore della silice e che non siano presenti bolle. Il modo migliore per farlo è aggiungere lentamente la silice saturata.
  7. Seguire i passaggi 4–8 del metodo di caricamento a umido sopra descritto per assorbire completamente il campione sulla colonna.

Raccolta delle frazioni e loro dimensioni

Per iniziare a raccogliere le frazioni, posiziona un contenitore adatto sotto la colonna e apri il rubinetto o togli il tappo. Per ogni colonna esiste una portata ottimale. Regola il rubinetto per controllare il flusso. Se la portata è troppo lenta, i processi di diffusione porteranno all’ampliamento della banda (parte “a” della figura). Se è troppo veloce, invece, non c’è abbastanza tempo per l’equilibrazione e il composto sarà costretto a scendere lungo la colonna, lasciando una lunga coda dietro (parte “c” della figura).

La modifica della portata può alterare la qualità della separazione. La portata ottimale è indicata in b).

Per colonne di piccolo diametro, la velocità ottimale è inferiore a quella per colonne di diametro maggiore. Pertanto, è possibile far funzionare colonne più grandi con una portata maggiore rispetto alle colonne più piccole. Inoltre, una cosa importante da tenere presente è che il livello del solvente non deve mai scendere sotto la parte superiore della silice (cioè deve “funzionare a secco”).

Il solvente deve essere reintegrato regolarmente e ben prima che sussista il pericolo che ciò possa accadere. Rabbocca il solvente quando più di 2 cm di solvente rimangono ancora sopra lo strato protettivo di sabbia. L’aggiunta anticipata di solvente, ovvero quando vi è ancora solvente nella colonna, contribuirà anche a ridurre al minimo i disturbi alla superficie della silice e la conseguente rottura di eventuali bande ancora presenti vicino alla parte superiore della colonna.

Controlla il “volume morto” prima dello smaltimento. Ci sarà un volume morto in cui non sarà presente alcun campione. La dimensione del volume morto dipende dalla dimensione della colonna e dai composti da separare. Potresti riuscire a vedere una linea corrispondente al solvente polare usato per dissolvere il campione. Questa può essere una buona guida per quando dovresti iniziare a raccogliere le frazioni.

Se non riesci a vedere una linea dal solvente polare, segna il livello iniziale del solvente tracciando l’esterno della colonna con una penna non permanente. Fai un secondo segno sulla colonna sotto il primo corrispondente ai due terzi della lunghezza della silice. Una volta che il livello del solvente scende al di sotto del secondo segno, è un buon momento per iniziare a raccogliere le frazioni. In caso di dubbi sulla posizione del composto sulla colonna, iniziare a raccogliere le frazioni prima piuttosto che dopo.

Stima del cosiddetto “volume morto”.

Per le colonne di grandi dimensioni, non ha senso raccogliere molte piccole frazioni: finiranno per essere ricombinate. Tuttavia, raccogliendo solo poche grandi frazioni può significare che finisci con due bande nella stessa frazione, specialmente se le bande escono dalla colonna vicine tra loro o c’è la coda della banda principale. Come guida approssimativa alla dimensione della frazione ideale, vedi la tabella.

Dimensioni approssimative della frazione per colonne di dimensioni diverse.

Come faccio a sapere quale delle mie frazioni raccolte contiene il mio prodotto? Poni un campione (spot) di ciascuna frazione su una piastra per cromatografia su strato sottile (TLC) e sviluppala come faresti con una test cromatografico su strato sottile. Per sapere come effettuare la cromatografia su strato sottile, leggi il nostro articolo Esperienze di cromatografia su strato sottile, che trovi qui. Rendi le piastre TLC più grandi del solito (circa 5 x 7 cm), in modo da poter controllare 5-10 frazioni per piastra.

Dopo aver isolato i tuoi prodotti, tutto ciò che rimane è svuotare e pulire la colonna per un nuovo uso. Per accelerare il processo, eluisci tutto il solvente utilizzando aria compressa e consenti all’aria di fluire attraverso la colonna per circa 2 ore. Ciò fornirà silice secca e scorrevole che è facile da versare nel contenitore dei rifiuti di silice. In alternativa, eluisci tutto il solvente e fissa la colonna sottosopra su un grande becher e lascia asciugare durante la notte. Sciacqua poi la colonna con acqua e acetone.