Come costruire uno spettrofotometro

In questo articolo viene proposto un progetto che consente agli studenti di progettare e costruire il proprio proprio spettrofotometro a luce visibile, dando loro un’esperienza pratica del funzionamento intimo di questo strumento analitico realizzabile da soli ad un costo modesto. Esso può essere usato per analizzare lo spettro visibile di una soluzione. Non solo gli studenti possono conoscere i componenti chiave dell’apparato, ma guadagnano anche l’esperienza nella calibrazione dello strumento stesso e una comprensione delle relazioni tra assorbimento della luce e concentrazione, e fra risoluzione e sensibilità.

Uno spettrofotometro è uno strumento molto utile per analizzare molti tipi di sostanze chimiche e per effettuare misure biologiche. I tipi più comuni sono progettati per la misurazione dell’assorbimento della luce nelle soluzioni, ma ci sono anche spettrofotometri con i quali puoi prendere misurazioni sui tessuti viventi o persino su singole cellule, e ci sono spettrofotometri a riflettanza per misure su superfici e molti altri tipi speciali. Una proprietà comune è che sono costosi.

Qui faremo vedere che è facile costruire uno spettrofotometro a basso costo. Non è uno strumento di precisione, ma è sufficiente per molti esperimenti e dimostrazioni di insegnamento. Uno spettrofotometro ha le seguenti parti principali: una lampada, un elemento di dispersione (di solito una griglia o reticolo riflettente) che divide la luce nelle sue componenti spettrali, un posto dove mettere il campione, un rilevatore di luce e qualche dispositivo per leggere o registrare il risultato.

Un esempio di spettrofotometro autocostruito.

La maggior parte degli spettrofotometri commerciali e di quelli usati nell’insegnamento di laboratorio sono guidati da un PC, che controlla le operazioni, archivia i file e manipola i dati, lasciando gli studenti ignari della fisica sottostante che porta alla misurazione. Invece, è importante per gli studenti capire il loro principio di base. Prendi una lampadina da 100 W, una resistenza dipendente dalla luce, un prisma con reticolo di diffrazione e davanti una fenditura, ed ecco lo spettrofotometro!

Il fotometro è costituito da una luce sorgente (un LED), una resistenza dipendente dalla luce (LDR) come rivelatore e un semplice circuito amplificatore / buffer per rendere l’uscita adatta per guidare un voltmetro. Se viene utilizzato un multimetro ad alta impedenza, l’amplificatore può essere omesso, ma normalmente è un componente importante di un “vero” fotometro.) Il LED e l’LDR sono posti uno di fronte all’altro e la cuvetta (contenitore per spettrofotometria) con il campione viene posta tra di essi.

Il fotometro una volta realizzato. Sono visibili il LED, l’LDR, l’amplificatore e la cuvetta per l’analisi.

La resistenza dell’LDR diminuisce man mano che la quantità di  luce che cade sull’LDR aumenta: più luce consente un maggiore flusso di corrente. Il circuito funziona con due batterie da 9 V. Per evitare errori causati dalla luce diffusa la stanza, il fotometro deve essere messo in una scatola. La figura mostra lo schema elettrico del fotometro. I componenti P1, P2 e P3 vengono generalmente omessi ma possono essere usati per sostituire le resistenze fisse con potenziometri, quindi permettendo il controllo dell’intensità della luce, del guadagno e dell’offset del circuito amplificatore.

Ecco l’elenco del materiale necessario per realizzare il fotometro e lo spettrofotometro:

• Circuito stampato
• Voltmetro o multimetro digitale
• Cuvette o bicchieri di vetro
• Sorgente luminosa bianca
• Reticolo di diffrazione
• Prisma
• Lente
• Supporti e morsetti per banco ottico
• Resistenze: 4,7 kΩ; 2.2kΩ; 1.0kΩ
• LED: arancione, 5 mm
• Fotoresistenza (LDR)
• Amplificatore operazionale: 3140
• Portapiedini a otto pin
• Clip batteria

Schema elettrico del fotometro. Il campione è posizionato tra il LED e l’LDR. L’uscita è collegata al voltmetro.

Con il fotometro possono venire esplorate le relazioni tra luce assorbita e luce trasmessa, e tra concentrazione e assorbanza. Tuttavia, il fotometro deve prima essere calibrato usando le concentrazioni standard di opportune sostanze colorate. Potete usare ad es. potassio manganato (vii), sali di cobalto, blu di molibdeno (sodio molibdato (vi), viola cristallo (esametilpararosanilina cloruro) e coloranti alimentari, sebbene possa essere necessario cambiare il colore del LED per migliorare la sensibilità.

Tutti i composti assorbono parte della luce che li colpisce, l’energia dalle radiazioni utilizzate eccita gli elettroni a livelli di energia superiore. L’assorbanza, A, di una soluzione del composto a una lunghezza d’onda particolare è descritta dalla legge Beer-Lambert, che è ampiamente usata nell’analisi quantitativa:

L’assorbanza è direttamente correlata alla concentrazione, c, del composto, alla lunghezza del percorso nel campione, l, e al coefficiente di assorbimento molare, ε, costante caratteristica dipendente dalla lunghezza d’onda del composto. I_o è l’intensità della luce incidente e I l’intensità della luce trasmessa.

Piuttosto che misurare l’assorbanza direttamente, il fotometro dà l’informazione sotto forma di tensione. Questo è vero anche negli strumenti commerciali, però questi ultimi contengono un processore interno per fare i calcoli matematici necessari. Tuttavia, la conversione è semplice e può essere prontamente fatta con una calcolatrice o con l’aiuto di un foglio di calcolo (ad es. Excel).

Un esempio di spettrofotometro commerciale. Ne trovi vari in vendita qui.

Così come l’assorbimento da parte del composto, altri processi riducono l’intensità della luce che passa attraverso la cuvetta, quindi è essenziale prendere una lettura di “background” per il solvente e la cella, che corrisponde a I_o. Non assumete che il circuito invia 0 V quando nessuna luce cade sul rivelatore ed effettuate la correzione sottraendo la tensione con luce zero (V_zero) da tutte le letture. Queste due procedure permettono di avere lo “zero” del fotometro.

Oltre la gamma di lunghezze d’onda e intensità luminose a cui siamo interessati, il fotometro mostra una relazione lineare tra la luce incidente e il rapporto di tensione descritto nell’equazione seguente (ii). Questa ipotesi è valida per intervalli di concentrazione utili, e il diagramma di calibrazione permetterà all’utente di sapere se è entrato in una regione di comportamento non lineare.

Alcuni voltmetri ad ago più vecchi possono essere impostati a zero manualmente, il che semplifica la questione dei calcoli. L’assorbanza è calcolata combinando le equazioni (i) e (ii) nella (iii), mostrata qui sotto. Dopo la calibrazione, usando un set di soluzioni standard per determinare ε, la misurazione di A consente di determinare la concentrazione di soluzioni sconosciute.

La figura seguente mostra un diagramma di calibrazione della concentrazione vs. il rapporto di tensione. Una volta completato, lo spettrofotometro qui presentato è adatto per monitorare la cinetica delle reazioni che comportano un cambio di colore, come ad esempio la misurazione della velocità di sbiancamento di un cristallo viola in presenza di idrossido di sodio.

Grafico di calibrazione dell’assorbanza vs. la concentrazione per soluzioni di permanganato di potassio (KMnO4) ottenute con lo strumento illustrato nel testo.

Oltre a una sorgente luminosa (una lampadina da 100 W o altra fonte policromatica) e al rivelatore, lo spettrofotometro richiede anche un prisma con reticolo di diffrazione per ottenere diverse lunghezze d’onda dalla sorgente luminosa, e una fessura per selezionare un intervallo ristretto di lunghezze d’onda. La “ristrettezza” di quest’ultimo determina la risoluzione dello strumento.

C’è, tuttavia, un inerente compromesso tra sensibilità e risoluzione, poiché una fessura più stretta fornisce una migliore risoluzione, ma meno fotoni con cui realizzare la misurazione. La fessura può essere fatta con del cartone, e posta fra reticolo e campione, oppure tra campione e rivelatore. Lo schema in figura mostra un layout tipico di spettrofotometro “fai-da-te”, dove lo spettro prodotto dal reticolo è proiettato su carta millimetrata per produrre una scala della lunghezza d’onda.

Schema dello spettrofotometro fai-da-te illustrato nel testo. La lente forma un’immagine dell’apertura sul piano di fronte alla fenditura.

Il reticolo può essere ruotato, oppure la fenditura e il campione spostati, per selezionare diverse lunghezze d’onda della luce. La calibrazione della lunghezza d’onda è eseguita dall’occhio, usando i numeri nella Tabella come guida. Per costruire uno spettro, l’assorbanza deve essere calcolata per ogni lunghezza d’onda, e quindi V_zero, V_acqua e V_campione devono essere misurati in ogni punto.

Tabella di calibrazione. Colori percepiti tipici e lunghezze d’onda corrispondenti della luce visibile. I colori percepiti variano tra gli individui, soprattutto al confine fra lunghezze d’onda.

La luce ambientale interferisce con lo spettrofotometro e causa imprecisioni, e quindi occorre una scatola di cartone di grandi dimensioni per mantenere la luce fuori. Lavorare con delle grandi tende scure e spesse è talvolta preferibile perché gli studenti possono lavorare sotto di esse. Se il tutto è realizzato con cura e la luce ambiente viene effettivamente esclusa, il fotometro è sufficientemente preciso per effettuare le misurazioni delle soluzioni di calibrazione e poi del campione che ci interessa.

Questo approccio pratico, con l’apprendimento basato sul fai-da-te, incoraggia l’ingegnosità e la creatività e dà agli studenti un vero senso di realizzazione. Naturalmente, non esiste un unico modo corretto di assemblare lo spettrofotometro, e potete effettuare delle migliorìe o variazioni. Un semplice strumento, ad esempio, può essere creato utilizzando filtri colorati al posto del gruppo reticolo-lente-fenditura, però il numero di punti-dati è limitato al numero di filtri colorati disponibili.

Lo spettrofotometro che abbiamo illustrato è certamente abbastanza buono per misurare concentrazioni sconosciute ed i tassi di reazioni semplici entro pochi per cento. Costruire lo spettrofotometro è impegnativo e deliberatamente evitiamo di fornire troppe istruzioni esplicite, però alcuni sperimentatori richiedono più guida di altri a seconda della loro abilità, fiducia ed esperienza. Il processo tramite prove ed errori assicura che ogni componente venga esplorato e il suo scopo compreso.

La capacità di risolvere lo spettro è limitata da quanto ampiamente la sorgente luminosa viene diffratta, e sebbene la struttura più fine dello spettro, ad esempio, del permanganato di potassio (KMnO4) non possa essere risolta, gli spettri ottenuti assomigliano ampiamente a quelli ottenibili con strumenti commerciali, ma nel nostro caso a una frazione della spesa. Dopo aver eseguito l’esperimento, tutti sono in grado di capire la legge di Beer-Lambert e come funziona uno spettrofotometro.

Regione visibile dello spettro del permanganato di potassio (KMnO4) ottenuta con lo spettrofotometro fai-da-te illustrato nel testo e confrontata con il risultato ottenuto con uno strumento commerciale.