Come costruire una centrifuga da laboratorio

La centrifugazione è una tecnica che sfrutta la forza generata da una centrifuga per separare i componenti aventi densità diversa di una sospensione. È impiegata in laboratorio, ad esempio, per purificare complessi macromolecolari, micelle, cellule e grosse strutture cellulari, materiale extracellulare, etc., in base alla diversa densità di questi rispetto al mezzo in cui sono sospesi o dispersi. In questo articolo vedremo come lo scienziato dilettante possa facilmente autocostruirsi, con una spesa modesta, una efficiente ultra-centrifuga da laboratorio utilizzabile prevalentemente per esperienze di biologia ma non solo.

La centrifugazione è un processo utilizzato per separare oppure per concentrare materiali, tipicamente sospesi in un mezzo liquido (per quanto riguarda le applicazioni in biologia). La base teorica di questa tecnica è l’effetto della gravità sulle particelle (comprese le macromolecole) in sospensione. Due particelle di diverse masse si depositano in una provetta a velocità diverse in risposta alla gravità. La forza centrifuga viene utilizzata nella centrifuga per aumentare questo tasso di sedimentazione.

Le centrifughe sono dispositivi utilizzati in una varietà di applicazioni scientifiche e tecniche che ruotano recipienti portanti (tipicamente, provette da centrifuga) a velocità di rotazione elevate e con forza centrifuga molto elevata. La forza centrifuga generata è proporzionale alla velocità di rotazione del rotore (in giri/min) e alla distanza tra il centro del rotore e il tubo della centrifuga. Pertanto, una data centrifuga può utilizzare più dimensioni del rotore per dare flessibilità nella scelta della forza.

Le centrifughe economiche in vendita sul web (ad es. qui) sono a bassa velocità.

Le centrifughe sono disponibili in tutte le forme e dimensioni (ne puoi acquistare alcune ad es. qui). Diverse marche di centrifughe utilizzano rotori diversi e ogni modello viene fornito con una tabella o un grafico che collega la forza centrifuga alla velocità di rotazione (rpm) per ciascun rotore che può utilizzare. Nei test di laboratorio dovresti sempre riportare la forza centrifuga usata e la durata del tempo a quella forza perché la forza centrifuga è l’unica unità trasferibile tra diverse centrifughe.

Uso e applicazioni delle centrifughe in biologia

Tutte le centrifugazioni vanno fatte con provette chiuse con tappi. Per la centrifugazione ad alta forza si usano speciali provette ad alta densità. Occorre accertarsi che venga utilizzato il rotore corretto e che sia installato correttamente sul mandrino. Occorre inoltre equilibrare il carico nel rotore: ogni tubo deve avere un tubo di bilanciamento nella fessura opposta con lo stesso volume di fluido. Rotori sbilanciati possono danneggiare o distruggere la macchina e, in alcuni casi, uccidere le persone.

Il rotore di una centrifuga professionale.

Tipicamente, il materiale da centrifugare viene inserito in una provetta da centrifuga, che viene poi posizionata in un rotore. Il rotore è generalmente un metallo denso che dissipa rapidamente il calore ed è di massa sufficiente da generare quantità di moto, cioè una volta che gira richiede poca energia per farlo funzionare. Le centrifughe professionali funzionano generalmente sotto vuoto e vengono refrigerate per ridurre il riscaldamento causato dalle forze di attrito mentre il rotore gira.

Il rotore viene fatto girare a velocità elevata (fino a 100 000 giri al minuto) per un certo tempo, sottoponendo così la sospensione a forze centrifughe pari a molte migliaia di volte la forza di gravità, cosa che causa la sedimentazione delle particelle che presentano anche minime differenze di densità rispetto al mezzo in cui si trovano. Da un miscuglio di materiale cellulare di solito si separano due frazioni: si chiama pellet il materiale compatto che resta sul fondo, e surnatante tutto ciò che rimane in sospensione.

Il possibile risultato di una centrifugazione di materiale cellulare.

La centrifugazione preparativa è tipicamente usata per separare cellule, frazioni subcellulari, organelli, virus, membrane o macromolecole da sottoporre ad analisi successive, mentre la centrifugazione analitica è tipicamente utilizzata per lo studio di caratteristiche di sedimentazione di molecole purificate, allo scopo di conoscere le componenti e le caratteristiche di molecole o particelle. In generale, i metodi preparativi possono essere utilizzati su scala diversa, adattandosi a quantità molto grandi o molto piccole di materiale di partenza, mentre quelli analitici utilizzano quantità piuttosto limitate.

In laboratorio si distinguono tre grandi tipi di centrifughe:

  • centrifughe da banco, utilizzate generalmente per isolare rapidamente materiali che sedimentano velocemente (cellule, nuclei, acidi nucleici o proteine, etc.); possono essere refrigerate od operare a temperatura ambiente; sono utili per centrifugare volumi relativamente piccoli (fino a 50 ml); hanno velocità da 4000 a 15.000 rpm; possono alloggiare sia rotori ad angolo fisso che a braccio oscillante;
  • centrifughe di grande capacità, utilizzate per la sedimentazione di cellule, batteri, frazioni subcellulari di grandi dimensioni, acidi nucleici e proteine precipitati; hanno capacità da pochi ml a oltre a 2 litri, e usano diversi rotori, ad angolo fisso o a braccio oscillante; raggiungono velocità fino a 25.000 rpm;
  • ultracentrifughe, refrigerate, con camera del rotore sigillata e sotto vuoto, per raggiungere velocità molto elevate; vengono utilizzate per la sedimentazione di acidi nucleici, proteine, piccoli organelli (ad es. ribosomi); raggiungono velocità max di 80.000 rpm; hanno uno stretto controllo di temperatura, velocità e del bilanciamento; trattano volumi piccoli ma possono arrivare fino a 200-300 ml.

Una ultracentrifuga preparativa (a sinistra) e una analitica (a destra).

La seguente formula viene utilizzata per convertire rpm in RCF, dove R è il raggio del rotore (cm) e S è la velocità (rpm): g = (1,118 x 10^-5) x R x S^2. Ogni centrifuga ha un grafico speciale, un normografo o una tabella che mette in relazione la velocità di rotazione (rpm) con la forza centrifuga (xg) per ogni dimensione di rotore che accetta. Con la precedente formula possiamo ricavarlo anche da noi.

Come realizzare una ultra-centrifuga

Per ogni scienziato dilettante pronto ad affrontare la biologia molecolare, la centrifuga è uno strumento di laboratorio essenziale. La sua rotazione superveloce fornisce le giuste forze per separare ordinatamente il materiale biologico – tra cui cellule, proteine e DNA – da un liquido. Le ultra-centrifughe di livello universitario costano circa 2.000 euro, ma un appassionato di biologia può costruirne una con un trapano Dremel 300 e una ruota stampata in 3D acquistabile sul web: il cosiddetto “dremelfuge”.

Il dremelfuge, rotore che può essere acquistato su Internet o stampato in 3D.

La combinazione di questi due componenti può far girare campioni fino a 33.000 giri / min, creando forze di 50.000 g, che la colloca nel cosiddetto territorio delle “Ultracentrifughe”. E se le centrifughe a bassa velocità (come quelle che trovate qui) sono ideali per la separazione di cellule intere, quelle a velocità più alte hanno una vasta gamma di applicazioni possibili.

Nello spirito dell’hardware open source, Dremelfuge è ora hardware open source. Come detto, è un rotore stampabile per la centrifugazione di provette per microcentrifuga standard e colonne miniprep. Rispetto al costo di una nuova centrifuga (al prezzo di almeno 500 euro su Google), un Dremelfuge è incredibilmente economico. Può essere utilizzato per una centrifuga da laboratorio o per alcuni usi culinari. Richiede provette Eppendorf / microcentrifuga standard da 1,5 ml /2 ml.

Utilizzato con un comune trapano a 3.000 giri / min, il Dremelfuge fornirà oltre 400 g, sufficienti per centrifugare comodamente i campioni Miniprep. Probabilmente otterresti risultati accettabili anche a velocità più basse. Utilizzata però a 10.000 rpm, ad esempio su uno strumento rotante come il Dremel, un Dremelfuge dovrebbe erogare oltre 4400 g, più che sufficiente per abbattere le cellule batteriche. A 16.000 rpm, Dremelfuge ha le prestazioni delle centrifughe commerciali.

Schema della centrifuga e il dremelfuge auto-stampato in 3D.

La ruota stampata in 3D sembra ingannevolmente semplice, con sei slot per tubi Eppendorf standard da 1,5 microlitri, orientati orizzontalmente. I primi prototipi erano spesso deformati, che si rompevano e sparavano tubi come proiettili di plastica sovradimensionati. Ma rimodellando le scanalature della ruota per cullare in sicurezza i bordi spessi dei tubi, non c’è stata mai più l’espulsione del tubo. Tuttavia, quando la si usa conviene usare estrema cautela e un’adeguata protezione per gli occhi.

Scarica quindi dal web gli schemi per la ruota Dremelfuge, digitando “dremelfuge designs” su Google. Due sono design disponibili; scegli quello adatto a un Dremel 300 (non a un trapano standard). Su un Dremel 300, una velocità massima di 33.000 rpm equivale a una forza di oltre 50.000 volte la gravità terrestre. Procedi alla stampa 3D della ruota in plastica ABS, con riempimento esagonale a rafforzarlo. Il PLA è un altro materiale di stampa comune, ma tende a frantumarsi sotto forti forze g. Se ti manca una stampante 3D, ordina la ruota online da Shapeways.com per circa 50 euro.

Il dremelfuge montato su un trapano Dremel (che trovi ad es. qui) diventa una centrifuga.

A questo punto, avvita un porta disco per utensile rotante nell’asse della ruota e collegalo a un Dremel (puoi acquistarlo qui). Inserisci eventuali provette contenenti un campione biologico nella ruota, assicurandoti che ciascuno abbia un contrappeso: un tubo sul lato contrario con una pari quantità di liquido. Altrimenti, potresti facilmente danneggiare la ruota e il Dremel. Tieni il Dremelfuge in un raffreddatore di polistirolo e lascialo girare! La schiuma assorbirà l’impatto se per caso un tubo si stacca durante l’uso.

AVVERTENZA: utilizzate una protezione per gli occhi infrangibile e azionate il Dremelfuge all’interno di un contenitore robusto, poiché il dispositivo può gettare pezzi di plastica a velocità pericolosamente elevate.

Come testare e bilanciare una centrifuga

Le cellule che rivestono le guance interne si trasformano costantemente in saliva ma sono troppo piccole per essere viste individualmente, il che le rende candidate perfette per testare il Dremelfuge. Metti un cotton-fioc in bocca e tampona le pareti per circa 10 secondi per afferrare alcune cellule della guancia. Immergi ripetutamente la punta di cotone in una provetta riempita con soluzione salina isotonica per rimuovere le cellule (puoi creare la soluzione di acqua salata e distillata da solo o la trovi in farmacia).

L’isolamento delle cellule tramite centrifugazione del campione prelevato.

Riempi una seconda provetta allo stesso livello dell’altra. Inserisci i tubi negli slot opposti nella ruota stampata in 3D. Fai girare la centrifuga per un minuto alla seconda impostazione del Dremel (circa 10.000 giri/min). Vedrai una pallina biancastra sul fondo dei tubi. Ecco: sono cellule della guancia isolate. E tutto questo ha richiesto circa 50 euro di spesa, 1 ora di lavoro per realizzare la centrifuga e pochi minuti per eseguire il semplice esperimento di biologia cellulare descritto.

Prima di avviare la centrifuga, è necessario caricarla correttamente. Il bilanciamento della centrifuga impedisce potenziali danni allo strumento ed è fondamentale per un funzionamento sicuro. Come bilanciare una centrifuga? Assicurarti che tutte le provette siano riempite uniformemente. Se sono necessarie ulteriori provette per il bilanciamento, riempile con acqua o un liquido di densità simile al campione e assicurati che la massa sia bilanciata entro gli 0,1 grammi più vicini.

Bilanciamento delle provette in una centrifuga a 12 posizioni.

Per ogni tubo inserito nel rotore, aggiungere un tubo di uguale peso direttamente di fronte. Ciò garantirà che il baricentro rimanga al centro del rotore. Ruota il rotore di 90° e aggiungi due tubi aggiuntivi uno di fronte all’altro. Come bilanciare 3 provette, 5 provette o 7 provette in una centrifuga con 12 posizioni? Esistono due modi per bilanciare tre tubi. Il primo è inserire tre provette una accanto all’altra e creare tre provette di bilanciamento da posizionare direttamente di fronte alle provette. In alternativa, tre provette possono essere distanziate uniformemente attorno al rotore.

Per bilanciare cinque tubi-provetta, crea un tubo di bilanciamento e posiziona due set di tre tubi uno di fronte all’altro. Per bilanciare sette tubi, crea un tubo di bilanciamento e posiziona due set di quattro tubi uno di fronte all’altro. Insomma, ora che hai capito la filosofia e l’importanza del bilanciamento, dovresti essere in grado di usare la tua ultra-centrifuga senza fare danni all’attrezzatura.

Bilanciamento corretto di un numero di provette dispari.