Come contare le colonie in microbiologia

Uno dei metodi classici per determinare la concentrazione di microbi in un campione è quello di diluire il campione, far crescere i microbi nelle capsule di Petri e contare le colonie. I microbi nelle capsule crescono, a partire da un nucleo di formazione di colonie costituito da una o più cellule, in una colonia visibile che può essere vista e contata. I batteri sono il microbo più comune da valutare usando il conteggio nelle capsule. I conteggi delle colonie sono usati per rilevare e contare i microbi nel suolo, nell’acqua e nel cibo. I protocolli per il conteggio delle colonie enfatizzano un approccio accurato e metodico.

Lo scopo del conteggio delle colonie di batteri o di cellule fungine nelle capsule di Petri è quello di stimare il numero di cellule presenti in base alla loro capacità di dare origine a colonie in condizioni specifiche di mezzo nutritivo, temperatura e tempo. L’ipotesi, infatti, è che ogni colonia sia separata e che sia stata fondata da una singola cellula microbica vitale, ovvero che una colonia rappresenti una cellula.

In teoria, una singola cellula vitale può dare origine a una colonia attraverso la replicazione. Tuttavia, le cellule solitarie sono l’eccezione in natura, e probabilmente il progenitore della colonia era una massa di cellule depositate insieme. Inoltre, molti batteri crescono in catene (ad es. lo Streptococco) o ciuffi (ad es. lo Stafilococco). Per questi motivi, la stima dei numeri microbici con i metodi che illustreremo sottovaluta, nella maggior parte dei casi, il numero di cellule viventi presenti in un campione.

La diluizione del campione

In microbiologia la cosiddetta “unità formante colonia” (CFU) è l’unità usata per stimare il numero di batteri vitali o di cellule fungine presenti in un campione, ed è definita come la capacità di moltiplicarsi tramite la fissione binaria in condizioni controllate. Il conteggio delle colonie nelle capsule di Petri è lineare (per l’E. coli) nell’intervallo di 30-300 CFU su una piastra Petri di dimensioni standard. Pertanto, per garantire che un campione produca CFU in tale intervallo, si richiede la diluizione del campione.

Il numero di colonie sulla capsula di Petri deve essere sempre compreso fra 30 e 300.

Se si spalma semplicemente un campione di microbo su una capsula con agar, vedrai così tante unità formanti colonie che le singole colonie si fondono insieme, rendendole impossibili da contare. Per risolvere questo problema, occorre mescolare il campione in un mezzo liquido, prendere una piccola quantità di quella miscela e diluirla ulteriormente. Ripeti questo processo ad es. 5 volte. Solitamente vengono usate diluizioni di 10 volte e la serie di diluizioni (dunque non soltanto la diluizione finale) viene coltivata in 2 o 3 capsule di Petri nell’intervallo di diluizioni scelto, prendendo nota di tutto.

Il numero di CFU per ciascuna capsula di Petri (o CFU/capsula) viene letto sulla capsula con uno dei metodi che illustreremo ed è lineare all’interno dell’intervallo descritto, quindi il CFU/g (o CFU/mL) dell’originale viene dedotto matematicamente, tenendo conto della quantità di CFU rilevata nella capsula e del suo fattore di diluizione. Ad esempio, una diluizione 1:10 che risulti in più di 200 CFU misurate su una capsula di Petri verrebbe riportata come “Concentrazione > 2.000 CFU/mL (o grammo)”. Le concentrazioni in CFU possono essere espresse usando la notazione logaritmica (in base 10).

Una soluzione di batteri a concentrazione sconosciuta viene quindi spesso diluita in serie al fine di ottenere almeno una capsula di Petri con un numero contabile di batteri. Un vantaggio di questo metodo è che diverse specie microbiche possono dare origine a colonie che sono chiaramente diverse l’una dall’altra, sia al microscopio che macroscopicamente. La morfologia a occhio nudo delle colonie può essere dunque di grande utilità nell’identificazione del microrganismo presente e nel suo conteggio.

Come si diluisce e si calcola la concentrazione delle colonie in un campione.

Una volta che il campione inizia a essere diluito attraverso la procedura in precedenza descritta, un suo piccolo volume (ad es. 1 ml) viene versato e distribuito sulla superficie di una capsula di Petri con agar (2 o 3 capsule per ogni diluizione ottenuta), e incubato per 4-7 giorni prima di contare le colonie. Può esserti in proposito utile leggere il nostro articolo “Come coltivare i batteri in modo corretto”, relativo alla corretta preparazione e gestione delle capsule di Petri ed alla loro incubazione in sicurezza.

Conteggio pratico delle colonie

Il modo tradizionale di enumerare le CFU è usando un “contatore di clic” e una penna. In pratica, il conteggio delle colonie viene eseguito manualmente utilizzando una penna e un contatore che conta i nostri “clic”. Questo è generalmente un compito semplice, ma può diventare molto laborioso e dispendioso in termini di tempo quando devono essere lavorate molte capsule. In alternativa, è possibile utilizzare soluzioni semi-automatiche (software) e automatiche (hardware + software).

Il trucco principale nel contare le colonie è, naturalmente, contare ogni colonia (spesso quasi puntiforme) una sola volta. Un approccio è quello di collocare la piastra di Petri su uno sfondo a griglia (ad es. una carta millimetrata trasparente illuminata dal retro) e contare le colonie presenti in ogni cella della griglia, muovendosi secondo uno schema metodico attraverso tutte le celle della griglia. Anche la marcatura delle colonie contate sul retro della capsula di Petri può essere un approccio utile.

Conteggio delle colonie con l’aiuto di una carta-griglia della 3M.

Generalmente, dovrai contare almeno tre capsule, in modo da poter determinare una media. Utilizza solo piatti contenenti da 30 a 300 colonie per fare inferenze robuste, come suggerito dai microbiologi professionisti. Le capsule con colonie troppo numerose da contare o con troppo poche colonie devono essere sostituite da capsule ottenute con una diversa diluizione. In alternativa, Quando le colonie sono troppo numerose, è pratica comune contare le CFU solo su una frazione della capsula.

Le colonie possono essere contate da foto della capsula usando strumenti software. Gli sperimentatori generalmente scattano una foto di ogni capsula che devono contare e poi analizzano tutte le immagini (ciò può essere fatto con una semplice fotocamera digitale o persino una webcam). Poiché impiegano meno di 10 secondi per scattare una singola foto, anziché alcuni minuti per contare manualmente la CFU, questo approccio generalmente consente di risparmiare un sacco di tempo. Inoltre, è più obiettivo e consente l’estrazione di altre variabili, come la dimensione e il colore delle colonie.

Vediamo alcuni software per il conteggio delle CFU. OpenCFU è un programma gratuito e open source progettato per ottimizzare la facilità d’uso, la velocità e la robustezza. Offre una vasta gamma di filtri e controlli e un’interfaccia utente moderna. OpenCFU è scritto in C ++ e utilizza OpenCV per l’analisi delle immagini. NICE è un programma scritto in MATLAB che fornisce un modo semplice per contare le colonie dalle immagini. Altri software utilizzabili per contare le colonie sono ImageJ e CellProfiler.

Il principale software di conteggio automatico delle colonie.

Se prendete in considerazione due o più capsule (o diluizioni), determinando separatamente CFU/mL (o grammo) per ciascuna di esse, dovete fare una media dei risultati per avere il risultato finale. Qualunque sia il metodo di conteggio scelto, poiché la CFU segue la distribuzione di Poisson, l’errore della stima è dato dalla radice quadrata della media. Perciò, quando il CFU/capsula scende al di sotto dell’intervallo numerabile, l’errore come percentuale della media aumenta rapidamente.

Limiti del metodo e alternative

L’accuratezza del calcolo della densità dei microbi dai conteggi delle colonie ha alcune limitazioni che è bene conoscere. Le unità che formano colonie possono essere una singola cellula, una catena di cellule o un intero gruppo di cellule. L’ipotesi è che una colonia rappresenti una cellula, tuttavia l’aspetto visivo di una colonia in una coltura cellulare richiede una crescita significativa e dunque, quando si contano le colonie, in realtà è incerto se la colonia sia sorta da una cellula oppure da un gruppo di cellule. Esprimere i risultati come unità formanti colonie (CFU) riflette questa incertezza.

Quindi le concentrazioni calcolate dai conteggi delle colonie possono essere più basse rispetto alle concentrazioni reali. Microbi diversi necessitano di condizioni di crescita diverse e le colonie sulla capsula rappresentano solo quei microbi che prosperano su quel mezzo di crescita in quelle condizioni di incubazione. Inoltre, il conteggio delle colonie registra le cellule vive ma non quelle morte – in contrasto con l’esame al microscopio, che conta tutte le cellule, vive o morte – una considerazione importante quando è necessaria la concentrazione delle cellule nel campione originale.

Il tipo di batteri presenti nel materiale in esame avrà un’influenza sulla dimensione delle colonie e, di conseguenza, su quante se ne possono sviluppare in una capsula. Le colonie vicine l’una all’altra si possono fondere e le colonie vicine possono inibire la crescita o, al contrario, stimolare la crescita. A causa di queste e altre difficoltà, alcune capsule di una serie prodotta da un dato campione sono più soddisfacenti per il conteggio rispetto ad altre. La selezione delle capsule da usare nel calcolo di un conteggio diventa quindi una questione che richiede un giudizio considerevole dell’operatore.

Un buon software di conteggio riconosce anche le colonie leggermente sovrapposte.

L’errore umano si aggiunge al tempo necessario al conteggio manuale delle colonie. Per migliorare sia la precisione che l’efficienza, i professionisti si affidano al conteggio automatico posizionando la capsula di Petri in un dispositivo di conteggio delle colonie automatizzato. I contatori automatici di colonie prendono un’immagine della capsula, separano le colonie dallo sfondo e poi usano un algoritmo per contare le colonie sul piatto. Gli algoritmi possono avere difficoltà a differenziare le colonie quando due o più colonie si toccano ai bordi, quindi questa è un’area di sviluppo software in corso.

Confronto delle crescite batteriche

I batteri sono microrganismi unicellulari, cioè composti da una sola cellula. Sono diversi dalle cellule vegetali e animali perché non hanno un nucleo distinto e racchiuso da una membrana che contiene materiale genetico: infatti, il loro DNA galleggia in un groviglio all’interno della cellula. I singoli batteri possono essere visti solo con un microscopio, ma si riproducono così rapidamente da formare spesso colonie che possiamo vedere a occhio nudo, ad esempio in una capsula di Petri.

I batteri si riproducono quando una cellula si divide in due cellule attraverso un processo chiamato fissione binaria. La fissione si verifica rapidamente, in appena 20 minuti. In condizioni ideali, un singolo batterio potrebbe moltiplicarsi in oltre un miliardo di batteri in sole 10 ore! È dunque una buona cosa che le condizioni naturali siano raramente ideali, altrimenti la Terra finirebbe sepolta nei batteri. Ma come si può confrontare la crescita delle colonie di batteri in diverse colture?

Il processo di fissione binaria di una cellula batterica.

La domanda non è peregrina. Supponiamo, ad esempio, che tu voglia misurare quantitativamente l’efficacia di un sapone. Oppure stabilire quale tipo di sapone – e quanto – è più efficace nell’eliminare i batteri. O ancora, capire quanto il sapone “antibatterico” funziona davvero meglio del normale sapone. O quanto bene ci si può pulire le mani con l’acqua senza sapone. In tutti questi test, più che i valori assoluti ci interessano i valori relativi dei batteri che crescono nella capsula di Petri.

In pratica, per ciascun test (ad es. del sapone), conta e registra il numero di colonie di batteri presenti in ciascuna capsula di Petri. Per verificare l’efficacia di ciascun sapone, dividi il numero di colonie nella capsula di test in base al numero di colonie nella capsula di controllo, quindi sottrai il risultato da 1 e scrivi la risposta come percentuale. Ad esempio, se la tua capsula di controllo aveva 100 colonie e quella di test del sapone ne aveva 30, il sapone elimina il 70% dei batteri: 1 – (30 ÷ 100) = 0,7% = 70%

Infine, se lo desideri, nel corso di un esperimento di questo tipo puoi misurare la crescita giornaliera delle colonie di batteri usando un pennarello per tracciare un cerchio attorno a ciascuna colonia sul fondo della capsula di Petri. Dopo diversi giorni, dovresti avere una collezione di anelli concentrici sul fondo di ogni capsula. Naturalmente, si raccomanda sempre di non aprire le capsule una volta avviata la crescita e di avere la supervisione di un adulto quando si lavora con i batteri.

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