Come analizzare il DNA con attrezzature fai-da-te

Quello che descriviamo in questa serie di 4 articoli è il primo laboratorio di DNA fai-da-te che puoi usare per fare test ovunque vi sia un DNA: può analizzare il DNA da saliva, capelli, tessuti animali e persino birra o vino. Esso consiste di tre apparati: una centrifuga per separare il DNA dalle cellule, una macchina per la PCR con la funzione di moltiplicare la quantità di DNA, e di un apparecchio per l’elettroforesi su gel, che permette di visualizzare e fotografare il DNA. Tutte queste attrezzature possono essere facilmente auto-costruite con una spesa modesta, trasformandovi in un biotecnologo dilettante.

Il tipo di attrezzatura necessaria per l’analisi del DNA è di solito molto costoso e richiede agli esperti di biologia molecolare o di biotecnologie di far funzionare varie attrezzature, ma il laboratorio che illustreremo in questa serie di 4 articoli costa meno di 200 euro, anziché gli oltre 10.000 euro di uno professionale, ed è certamente conveniente per testare una varietà di prodotti la cui analisi potrebbe costare cifre astronomiche se fatta presso un normale laboratorio esterno.

Raccogli un campione di cellule e mettilo nella centrifuga – la cui auto-costruzione è illustrata nel nostro articolo Come costruire una centrifuga da laboratorio, che trovi qui – per l’estrazione del DNA. Una macchina per la PCR – la cui auto-costruzione è illustrata nel nostro articolo Come fare la PCR per moltiplicare il DNA, che trovi qui – copia e amplifica le molecole di DNA. E, infine, un apparecchio per l’elettroforesi su gel – vedi il nostro articolo che trovi qui – consente di visualizzare il DNA.

Le tre fasi con apparecchi fai-da-te che permettono a un dilettante l’analisi del DNA.

Il tuo laboratorio di biologia molecolare, oltre ai tre apparecchi auto-costruiti appena menzionati, dovrà contenere pipette, reagenti, bastoncini di cotone per la raccolta dei campioni, coloranti per l’elettroforesi, un kit per la reazione PCR, etc. In compenso, potrai caratterizzare il DNA della carne presente nel tuo hamburger e scoprire se è di cavallo, identificare i funghi velenosi e quelli non velenosi, scoprire chi ha lasciato i peli in giro per la tua casa, e tanto altro ancora: sarai limitato solo dalla fantasia.

Per comprendere le tecniche di base utilizzate per lavorare con gli acidi nucleici (DNA e RNA), ricorda che gli acidi nucleici sono macromolecole costituite da nucleotidi (uno zucchero, un fosfato e una base azotata). I gruppi fosfato su queste molecole hanno ciascuna una carica negativa netta. Un intero insieme di molecole di DNA nel nucleo degli organismi eucariotici è chiamato genoma. Il DNA ha due caratteristici filamenti complementari collegati da legami idrogeno tra le basi accoppiate.

La caratteristica struttura a doppia elica del DNA.

L’estrazione del DNA e l’uso della centrifuga

Per studiare o manipolare gli acidi nucleici, il DNA deve essere prima estratto dalle cellule. Varie tecniche sono utilizzate per estrarre diversi tipi di DNA. La maggior parte delle tecniche di estrazione dell’acido nucleico prevedono passaggi per rompere la cellula e quindi l’uso di reazioni enzimatiche per distruggere tutte le macromolecole indesiderate. Le cellule vengono aperte usando una soluzione detergente contenente dei composti tampone. Per prevenire la degradazione e la contaminazione, le macromolecole come proteine e RNA vengono inattivate mediante enzimi.

Il DNA viene poi estratto dalla soluzione usando alcol isopropilico. Il DNA risultante, poiché è costituito da lunghi polimeri, forma una massa gelatinosa. Questo metodo estrae tutto l’acido nucleico all’interno di una cellula (ed è stato illustrato nel nostro articolo Come estrarre il DNA dalle cellule, che trovi qui). Ciò include il DNA genomico (tutto il DNA nel genoma) e l’RNA. Se questo DNA dovesse essere utilizzato per ulteriori studi, l’RNA andrebbe digerito con un enzima per rimuoverlo. La seguente figura riassume il metodo base utilizzato in laboratorio per l’estrazione del DNA dalle cellule.

Schema dell’estrazione del DNA cellulare

Il metodo prevede, sostanzialmente, quattro fasi distinte: Fase 1: attraverso l’uso di un detergente, viene dissolta la membrana plasmatica. Fase 2: Il contenuto delle cellule viene trattato con la proteasi per distruggere le proteine e con la RNA-asi per distruggere l’RNA. Fase 3: i detriti cellulari vengono trasformati in pellet con l’ausilio di una centrifuga, e al termine della centrifugazione il supernatante (la parte liquida) contenente il DNA viene trasferito in una provetta pulita. Fase 4: il DNA viene fatto precipitare con l’etanolo, formando degli accumuli viscosi chiaramente riconoscibili.

A differenza del DNA nelle cellule eucariotiche, le molecole di RNA lasciano il nucleo. L’RNA Messaggero (mRNA) viene analizzato spesso perché rappresenta i geni codificanti le proteine che vengono espressi nella cellula. L’RNA è quindi studiato per comprendere i modelli di espressione genica nelle cellule. L’RNA è molto instabile perché gli enzimi che scompongono l’RNA sono comunemente presenti in natura e sono molto difficili da inattivare. Simile all’estrazione del DNA, l’estrazione dell’RNA comporta l’uso di vari tamponi ed enzimi per inattivare altre macromolecole e preservare solo l’RNA.

Osservazioni varie sull’estrazione del DNA

Senza una preparazione del DNA genomico ad alta densità e di alta qualità, la qualità degli studi genetici è ridotta o addirittura non utilizzabile. Per l’analisi genetica – ad esempio nel caso delle piante – dobbiamo prima estrarre il DNA dalle piante bersaglio che ci interessano. Dalle piante modello come l’arabidopsis (Arabidopsis thaliana) e il tabacco (Nicotiana tabacum) è relativamente facile estrarre il DNA, ma d’altra parte il DNA non viene efficacemente estratto da molte piante orticole.

Le foglie delle piante costituiscono un’ottima fonte di DNA.

Potete provare l’estrazione del DNA da soli da una varietà di piante come arabidopsis, riso, wasabi, robinia, petunia, ciclamino, melo e genziana. Il DNA genomico viene solitamente estratto da foglie sane. Le persone spesso estraggono il DNA dai tessuti molli agli apici delle riprese, ma tali campioni sono limitati sia in termini di qualità che nelle stagioni dell’anno. Questo è il motivo per cui di solito conviene estrarre il DNA dalle foglie più vecchie per avere DNA ad alta densità e alta qualità.

I kit di estrazione del DNA come DNeasy (QIAGEN, Venlo, Paesi Bassi) sono raccomandati per l’estrazione di una quantità relativamente piccola di DNA puro da piante modello, ma non è possibile utilizzare questi kit per piante “recalcitranti” (difficili). Ma vediamo come quantificare il DNA genomico estratto dalle piante, in modo da stimare la quantità del DNA ottenuto. Chiunque abbia estratto il DNA dovrebbe poterne misurare la cosiddetta assorbanza UV (cioè la quantità di luce UV assorbita).

Un kit per l’estrazione del DNA in vendita sul web. Puoi trovare le provette Eppendorf ed economici kit per il DNA con una ricerca online, partendo ad esempio da qui.

La concentrazione di DNA nella soluzione acquosa è calcolata, per l’assorbanza a 260 nm (detta “A260”) come: c = 50 · A260 (ng/µL). Ad esempio, si stima che una soluzione con il valore di A260 di 0,500 contenga 25 ng/µL di DNA. Questa misurazione è corretta per campioni di DNA puro. La misurazione dell’assorbanza UV viene eseguita da uno spettrofotometro UV, che può misurare l’assorbanza con una piccola quantità (circa 4 µL) di soluzione di DNA. Si dice che i rapporti di assorbanza UV mostrano la qualità del DNA: si stima che il DNA sia puro se i rapporti A260/A280 e A230/A280 sono circa 1,9.

In realtà, il DNA estratto non può essere quantificato dall’assorbanza UV. Ci sono spesso grandi differenze tra le concentrazioni di DNA stimate con i raggi UV e le concentrazioni di DNA reali. Il DNA non è nemmeno contenuto nella soluzione, anche se i valori di assorbanza UV sono buoni. Questo perché ci sono impurità nel DNA estratto dalle piante, che in molti casi causano un’assorbanza UV simile a quella del DNA. Le concentrazioni di DNA stimate con i raggi UV sono solo stime basate sulla spettrometria.

Per misurare la vera quantità di DNA genomico, è necessario eseguire l’elettroforesi su gel di agarosio, di cui parleremo più avanti. Di solito, si caricano 300, 100 e 30 ng di λ-DNA come riferimento standard in pozzetti separati. Questi standard sono elettroforetizzati con 300 ng di DNA estratto dalle piante. Ad esempio, la purezza del DNA estratto è del 33% se la densità di banda di 100-ng λ-DNA e l’estratto di pianta sono uguali. Le purezze dell’estratto di DNA vegetale sono generalmente inferiori al 10% solo con i trattamenti popolari con precipitazione PCI, RNasi ed etanolo.

Il tipico spettrofotogramma di un campione di DNA. Lo spettrofotometro puoi auto-costruirlo oppure acquistarlo online, ad esempio qui.

Approfondimenti sulla purezza e sulla quantità del DNA aiuteranno molto a giudicare se le soluzioni di DNA estratte dalle piante sono abbastanza buone per gli esperimenti. Il DNA verrà estratto con un metodo più competente se la quantità non è sufficiente, e il DNA verrà purificato se la qualità non è sufficiente. Un metodo di estrazione del DNA adatto a una specie di pianta non funziona necessariamente nelle altre specie. Alcuni metodi di estrazione del DNA richiedono molte manipolazioni, quindi non sono applicabile a un’analisi di centinaia di piante. I metodi rapidi sono le soluzioni a questo problema.

Come moltiplicare il DNA: la macchina per PCR

L’analisi del DNA richiede spesso di concentrarsi su una o più regioni specifiche del genoma. Spesso comporta anche situazioni in cui sono disponibili solo una o poche copie di una molecola di DNA per ulteriori analisi. Queste quantità sono insufficienti per la maggior parte delle procedure, come ad esempio l’elettroforesi su gel per visualizzare il DNA, che illustreremo più avanti.

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica utilizzata per aumentare rapidamente il numero di copie di una regione specifica di DNA per ulteriori analisi. Tipicamente, il DNA utilizzato come campione iniziale in una reazione di PCR è il DNA genomico, che contiene tutti i geni nell’organismo. La PCR utilizza una forma speciale di DNA polimerasi resistente al calore, l’enzima che replica il DNA e altre brevi sequenze di nucleotidi chiamate primer che si accoppiano a una porzione specifica del DNA da copiare. Una reazione di PCR non copia l’intero genoma, ma crea milioni di copie di una specifica regione di interesse.

Una macchina autocostruita per la PCR.

La PCR prevede i seguenti passaggi di base: (1) Denaturazione (a 94 °C); (2) Ricottura (a 54-60 °C); (3) Estensione (a 72 °C). Essi possono essere effettuati con un termociclatore, o macchina per PCR, auto-costruito. I tre passaggi fondamentali di una reazione PCR vengono ripetuti più volte (“cicli”). Ogni ciclo provoca un aumento di circa 2x del numero di copie amplificate della specifica sezione di interesse. Ricorda che solo una sezione del DNA viene amplificata a causa della specificità dei primer.

La PCR viene utilizzata per molti scopi nei laboratori. Questi includono: 1) l’identificazione del proprietario di un campione di DNA lasciato sulla scena del crimine; 2) analisi di paternità; 3) il confronto di piccole quantità di DNA antico con organismi moderni; 4) determinazione della sequenza di nucleotidi in una regione specifica. In tutti questi casi, il campione iniziale è il DNA genomico. In alcuni casi, il genoma completo potrebbe non essere presente a causa del DNA vecchio o scomposto.

Naturalmente, una certa quantità di DNA modello deve essere aggiunta alla miscela di reazione, ma una quantità eccessiva di DNA inibirà l’amplificazione della PCR. Tipicamente, 5 ng di DNA modello sono abbastanza per l’amplificazione. Le concentrazioni degli stock di DNA sono spesso piuttosto elevate. Ad eccezione del DNA a bassa densità come la soluzione preparata con il metodo di estrazione rapida di arabidopsis, gli stock di DNA sono generalmente diluiti da 100 a 1000 volte con acqua distillata sterilizzata prima di essere aggiunti alle provette per la reazione PCR.

La concentrazione giusta del DNA è importante per una buona riuscita della PCR.

È anche importante confrontare una serie di diluizioni di DNA (ad esempio 1/1, 1/10, 1/100, 1/1000 e 1/10000) per determinare la scala di diluizione migliore. Esiste quindi una stretta relazione tra il protocollo di estrazione del DNA e il protocollo di analisi PCR. Per quanto sia preparato un DNA pulito, condizioni PCR errate non riusciranno ad amplificare il DNA target. Al contrario, il DNA target può essere amplificato anche dal DNA modello a bassa concentrazione, quando la condizione della PCR è corretta.

Come visualizzare il DNA: l’elettroforesi su gel

Poiché gli acidi nucleici sono ioni carichi negativamente a pH neutro o alcalino in un ambiente acquoso, possono essere spostati da un campo elettrico. L’elettroforesi su gel di agarosio è una tecnica utilizzata per separare le molecole cariche in base alle dimensioni e alla carica. Gli acidi nucleici possono essere separati come interi cromosomi oppure come frammenti. Si noti che gli acidi nucleici in una matrice di gel sono invisibili fino a quando non vengono colorati con un composto che consente loro di essere visti, come ad esempio un colorante fluorescente sotto i raggi ultravioletti (UV).

In pratica, i campioni degli acidi nucleici da visualizzare, forniti dalla PCR, vengono caricati in una fessura posta a un’estremità di una matrice di gel, viene applicata una corrente elettrica e le molecole caricate negativamente vengono attirate verso l’estremità opposta del gel (l’estremità con l’elettrodo positivo). Le molecole più piccole si muovono attraverso i pori del gel più velocemente delle molecole più grandi; questa differenza nel tasso di migrazione separa i frammenti in base alla dimensione.

Visualizzazione di vari campioni di DNA dopo l’elettroforesi su gel di agarosio.

Frammenti distinti di acidi nucleici appaiono – se si usa un colorante – come vere e proprie “bande” a specifiche distanze dalla parte superiore del gel (l’estremità dell’elettrodo negativo), che si basano sulla loro dimensione. Una scala standard, o DNA ladder, è tipicamente inclusa in modo da poter determinare la dimensione dei frammenti nel campione fornito dalla PCR. Una miscela di molti frammenti di varie dimensioni appare come una lunga macchia, mentre il DNA genomico non tagliato è di solito troppo grande per attraversare il gel e forma una singola grande banda nella parte superiore del gel.

Una banda di DNA contiene molte, molte copie della regione del DNA “bersaglio” (cioè quella che ci interessa), non solo una o poche copie. Poiché il DNA è microscopico, molte copie di esso devono essere presenti prima che possiamo vederlo ad occhio nudo (oppure che possiamo fotografarlo). Questa è il motivo principale per cui la PCR è uno strumento importante: produce abbastanza copie di una sequenza di DNA in modo che possiamo vedere o manipolare quella regione di DNA.