Analisi del seme e osservazione degli spermatozoi

Gli spermatozoi umani hanno una larghezza compresa tra 2,5 e 3,5 micron (micrometri) e hanno una lunghezza compresa tra 5 e 7 micron. Dovresti essere in grado di vederli piuttosto bene già a 400x con un microscopio. La microscopia a contrasto di fase sarà di grande aiuto nella visualizzazione degli spermatozoi. Avrai bisogno di un microscopio composto con un condensatore di fase. Ciò ti permetterà di effettuare delle straordinarie osservazioni degli spermatozoi vivi in movimento e di compiere almeno una parte dell’istruttiva analisi del tuo seme (o di quello altrui) proposta in questo articolo.

Lo sperma normale è una miscela di spermatozoi sospesi nelle secrezioni del testicolo e di epididimi che, al momento dell’eiaculazione, si combinano con le secrezioni della prostata, delle vescicole seminali e delle ghiandole bulbouretrali. La composizione finale è un fluido viscoso che comprende l’eiaculato. L’analisi del seme fornisce informazioni essenziali sullo stato clinico dell’individuo. L’analisi del seme è divisa, tradizionalmente, in esame macroscopico e microscopico del campione.

L’esame macroscopico valuta: (1) liquefazione; (2) aspetto; (3) volume; (4) viscosità; (5) pH. L’esame microscopico, invece, valuta: (1) la motilità degli spermatozoi; (2) la concentrazione degli spermatozoi; (3) la vitalità degli spermatozoi mediante esclusione di coloranti (test di eosina); (4) la morfologia degli spermatozoi; (5) gli elementi cellulari diversi dagli spermatozoi. Di seguito vengono proposti alcuni esami che puoi effettuare su un campione di sperma a casa od a scuola.

Alcuni capisaldi dell’analisi del seme.

Guardare gli spermatozoi al microscopio è affascinante. Ci sono quelli un po’ di fretta che viaggiano a tutta velocità, così come altri che nuotano in cerchio come se si fossero persi. Ci sono anche cellule spermatiche o frammenti cellulari morti. Secondo la letteratura, una certa percentuale di scarti di cellule spermatiche è in realtà abbastanza normale. Tuttavia, per coloro che desiderano anche sapere come viene fatto il conteggio degli spermatozoi e valutato il loro stato, ecco le basi.

Esame macroscopico di un campione di seme

Liquefazione. Un campione di sperma normale si liquefa entro 60 minuti a temperatura ambiente, sebbene di solito ciò si verifica entro 15 minuti. In alcuni casi, la liquefazione completa non si verifica entro 60 minuti e ciò dovrebbe essere registrato. Durante la liquefazione, mescolare delicatamente o ruotare di continuo il contenitore del campione può ridurre gli errori nel determinare la concentrazione di spermatozoi.

Analisi macroscopica del seme. Che cosa viene misurato.

Aspetto. Un normale campione di sperma liquefatto ha un aspetto omogeneo, grigio-opalescente. Esso può apparire meno opaco se la concentrazione degli spermatozoi è molto bassa; il colore può anche essere diverso, cioè rosso-marrone quando sono presenti globuli rossi (emospermia) o giallo in un paziente con ittero o assunzione di alcune vitamine o droghe.

Volume. Il volume viene misurato al meglio ponderando il campione nella provetta cui si trova raccolto. Raccogliete il campione in un contenitore monouso pre-pesato. Pesate la provetta con il seme. Sottraete il peso del contenitore. Calcolate il volume dal peso del campione, assumendo che la densità del seme sia di 1 g/ml o leggete il volume direttamente dalla provetta graduata.

Viscosità. La viscosità del campione liquefatto può essere stimata aspirando delicatamente in una pipetta monouso in plastica a diametro largo (circa 1,5 mm di diametro), facendo cadere il seme per gravità e osservando la lunghezza di qualsiasi filo. Un campione normale lascia la pipetta in piccole gocce. Se la viscosità è anormale, la goccia formerà un filo lungo più di 2 cm. In alternativa, la viscosità può essere valutata introducendo un’asta di vetro nel campione e osservando la lunghezza del filo che si forma al ritiro dell’asta. Il filo non deve superare i 2 cm.

L’analisi morfologica degli spermatozoi fa parte invece dell’analisi microscopica.

pH. Una goccia di sperma viene distribuita uniformemente sulla carta per la misurazione del pH (intervallo: da pH 6.l a l0.0 o da 6.4 a 8.0) oppure la cartina indicatrice viene immersa per un momento nel campione di sperma. Dopo 30 secondi, il colore della zona impregnata deve essere uniforme e viene confrontato con la striscia di calibrazione fornita per leggere il valore del pH.

Esame microscopico di un campione di seme

Preparazione per l’analisi di routine (preparazione a umido)

Prima di rimuovere un po’ di sperma per la valutazione, mescola bene il campione nel contenitore originale, ma non così vigorosamente da creare bolle d’aria. Ciò può essere ottenuto aspirando il campione 10 volte in una pipetta monouso in plastica di circa 1,5 mm di diametro. Poi 10 μl di sperma vengono posti su un vetrino pulito con una pipetta automatica e coperti con un vetrino da 22 mm x 22 mm.

La preparazione bagnata appena fatta viene lasciata stabilizzare. Valuta la preparazione bagnata appena fatta non appena i contenuti non vanno più alla deriva. Fornisci una valutazione iniziale con osservazione al microscopio a un ingrandimento totale 100x (cioè 10x obiettivo e 10x oculare). Fai una panoramica per determinare la formazione del filamento di muco, l’agglutinazione e l’aggregazione degli spermatozoi, e l’uniformità della diffusione degli spermatozoi sulla diapositiva. La preparazione viene poi esaminata con un ingrandimento di 400x di ingrandimento totale (ad es. 40x obiettivo e 10x oculare).

Spermatozoi osservati a 1000x al microscopio ottico da un dilettante.

Gli spermatozoi puoi vederli già a 200x, anche se è più divertente se vai più in alto con gli ingrandimenti. Non è necessaria la preparazione del vetrino, il campione dovrebbe arrivare nel suo “mezzo”, puoi semplicemente aggiungere una goccia di sperma liquefatto (tempo di attesa da 15 a 30 minuti) tra il vetrino portaoggetto e quello coprioggetto, mescola bene al centro del vetrino e osserva. Guardare lo sperma al microscopio è un esperimento scientifico di base nella scuola superiore.

Stima preliminare della concentrazione di spermatozoi

La scansione del vetrino e la stima del numero di spermatozoi nel campo viene utilizzata per decidere la diluizione per poter determinare la concentrazione di spermatozoi mediante emocitometria. Se il numero di spermatozoi per campo visivo varia considerevolmente, indica che il campione non è omogeneo. In tali casi, il campione di sperma deve essere nuovamente miscelato accuratamente. Prepara due diluizioni uguali del campione di sperma. La diluizione del campione di sperma con il fissativo viene effettuata in due provette di diluizione (tubi di Eppendorf). Ecco la procedura da seguire.

Utilizzando una pipetta automatica, eroga prima la quantità appropriata di fissativo in entrambe le provette di diluizione; mescola bene il campione di sperma; aspira il volume appropriato di sperma immediatamente dopo la miscelazione, non dando tempo agli spermatozoi di stabilizzarsi; pulisci lo sperma all’esterno della punta della pipetta; dispensa lo sperma in un fissativo in una delle provette di diluizione e risciacqua la punta della pipetta aspirando ed assorbendo un po’ di fissativo; mescola di nuovo bene il campione di sperma e prepara la diluizione replicando i passaggi precedenti.

Vitalità dello sperma per esclusione di coloranti – Test di eosina

La vitalità dello sperma si riflette nella proporzione di spermatozoi che sono “vivi” come determinata mediante esclusione di coloranti (test di eosina).

Come appaiono gli spermatozoi nel test dell’eosina che ora illustreremo.

La procedura è la seguente:

• mescola bene il campione di sperma
• rimuovi una quantità di 5 μl di sperma e combina con 5 μl di soluzione di eosina su un vetrino microscopico, copri con vetrino coprioggetto e lascia per 30 s. (prepara in replica)
• esamina ogni vetrino con ingrandimento x400
• calcolare il numero di spermatozoi macchiati (morti) e non macchiati (vitali) con l’aiuto di un contatore da laboratorio
• calcola la media e la differenza delle due percentuali di cellule vitali da replicare
• determina l’accettabilità della differenza (v. Tabella)
• se la differenza è accettabile, calcola la concentrazione. Se anche la differenza è alta, prepara due nuove diluizioni come descritto sopra e ripeti i conteggi delle repliche
• arrotonda la percentuale media di spermatozoi vitali e morti al numero intero più vicino e annotalo.

Tabella. Accettabilità della differenza citata nel testo.

Analisi della morfologia dello sperma

I criteri seguenti dovrebbero essere applicati quando si valuta la normalità morfologica di uno spermatozoo. Gli spermatozoi consistono in una testa, un collo, un pezzo intermedio (parte centrale), un pezzo principale e una testa. Poiché il pezzo finale è difficile da vedere, si può considerare che la cellula comprende una testa (e collo) e una coda (parte centrale e parte principale). Perché uno spermatozoo sia considerato normale, sia la testa che la coda devono essere normali.

Le parti principali di uno spermatozoo.

Tutti i casi borderline devono essere considerati anormali:

• La testa deve essere liscia, regolarmente sagomata e generalmente di forma ovale. Dovrebbe esserci una regione acrosomiale ben definita che comprende il 40-70% dell’area della testa. La regione acrosomiale non dovrebbe contenere grandi vacuoli e non più di due piccoli vacuoli, che non dovrebbero occupare più del 20% della testa dello spermatozoo. La regione post-acrosomiale non deve contenere vacuoli.
• Il pezzo centrale dovrebbe essere snello, regolare e circa della stessa lunghezza della testa. L’asse maggiore del pezzo centrale dovrebbe essere allineato con l’asse maggiore della testa. Il citoplasma residuo è considerato solo un’anomalia quando in eccesso, cioè quando supera un terzo della dimensione della testa.
• Il pezzo principale dovrebbe avere un calibro uniforme lungo la sua lunghezza, essere più sottile rispetto al pezzo centrale ed essere lungo circa 45 µm (circa 10 volte la lunghezza della testa). Può essere ricollegato su se stesso, purché non vi siano angoli acuti, indicativi di rottura flagellare.

Sperma umano osservato al microscopio con la tecnica del contrasto di fase.

La procedura con cui eseguire l’esame è la seguente:

• esamina attentamente gli spermatozoi (secondo il loro numero dalle microfotografie sulla piastra n. 7 o 8 o 9 o 10)
• annota la classificazione: normale / anormale
• se necessario, descrivi il difetto: ad es. testa senza parte acrosomiale, testa amorfa, pezzo centrale spesso, coda arrotolata, etc.

Tabella di riferimento con i valori tipici di un’analisi dello sperma.

Come valutare la concentrazione di spermatozoi

La concentrazione di spermatozoi deve essere determinata usando il metodo emocitometrico su due preparazioni separate del campione di sperma. La diluizione necessaria è determinata dalla stima preliminare della concentrazione di spermatozoi (vedi tabella).

Tabella. Il grado di diluizione da applicare al campione.

Fissa il coprioggetto sulle camere di conteggio di un emocitometro Neubauer (lo trovi ad es. qui) bagnando leggermente entrambi i lati dei pozzetti (utilizza una goccia d’acqua sul dito). Premi saldamente il coprioggetto sulle camere in modo da osservare l’iridescenza (anelli di Newton) tra le due superfici di vetro. Trasferisci circa 10 μl di campione diluito accuratamente miscelato da ciascuna diluizione duplicata in ciascuna delle camere di conteggio dell’emocitometro. Le camere non devono essere sovra-riempite o insufficientemente riempite e il vetro di copertura dovrebbe non essere mosso.

Un campione di sperma viene posto sull’emocitometro (puoi acquistarlo ad es. qui).

L’emocitometro può essere lasciato riposare per circa 5 minuti in una camera umida per prevenire l’essiccazione. Le celle vengono quindi conteggiate con un ingrandimento compreso tra 200 e 400x. Il conteggio dovrebbe essere fatto per gli spermatozoi completi (teste con code). La procedura per contare gli spermatozoi nella camera dell’emocitometro è la seguente:

• esamina l’emocitometro con ingrandimento x200 o x400
• conta almeno 200 spermatozoi in ciascun replicato, al fine di ottenere un errore di campionamento accettabile (vedi tabella qui sotto)

Tabella. Accettabilità della differenza nei conteggi dovuta all’errore casuale.

• valuta la griglia centrale di un lato dell’emocitometro Neubauer, riga per riga
• continua a contare fino a quando sono stati osservati almeno 200 spermatozoi ed è stata esaminata la riga completa (di 5 quadrati grandi). Il conteggio deve essere eseguito per righe complete; non fermarti nel mezzo di una fila. Se non ci sono 200 spermatozoi osservati nelle 5 file della cintura centrale (n.5), continua a contare nelle file (di 4 grandi quadrati) delle due travi adiacenti (n. 4 e n. 6, in figura)
• annota il numero di file valutate per raggiungere almeno 200 spermatozoi. Lo stesso numero di file verrà conteggiato dall’altra camera del dell’emocitometro
• passa alla seconda camera dell’emocitometro ed esegui la conta dei replicati sullo stesso numero di righe del primo replicato, anche se questo produce meno di 200 spermatozoi.

L’emocitometro Neubauer citato nel testo.

• calcola la somma e la differenza dei due numeri (conteggi)
• determina l’accettabilità della differenza dalla tabella (mostra la massima differenza tra i conteggi previsti nel 95% del campione attesi per il solo errore di campionamento)
• se la differenza è accettabile, calcola la concentrazione. Se anche la differenza è alta, prepara due nuove diluizioni come descritto sopra e ripeti i conteggi delle repliche
• riporta la concentrazione media di spermatozoi con due cifre significative
• calcola il numero totale di spermatozoi per eiaculato (vedi sotto).

Guarda la figura qui sotto.

Come effettuare il conteggio nella griglia.

Quella di mezzo delle tre linee definisce il confine del quadrato (riquadro a sinistra della linea nera) e:

• vengono contati tutti gli spermatozoi all’interno della piazza centrale
• vengono contati gli spermatozoi con la testa tra le due linee interne (cerchi bianchi, pannello di sinistra)
• non contare gli spermatozoi quando la loro testa giace tra le due linee esterne (cerchi neri, riquadro a sinistra)
• uno spermatozoo con la maggior parte della sua testa che giace sulla linea centrale viene conteggiato solo se quella linea è la linea inferiore o sinistra del quadrato (cerchi bianchi, pannello centrale)
• uno spermatozoo con la maggior parte della sua testa che giace sulla linea centrale non viene conteggiato se quella linea è la linea superiore o destra del quadrato (cerchi neri, pannello di destra).

Spermatozoi visti al microscopio elettronico (SEM).

La concentrazione di spermatozoi (C) nello sperma è il loro numero (N) diviso per il volume in cui sono stati trovati, ovvero il volume del numero totale (n) di righe esaminate per il replicato (20 nl ciascuno per le grid 4,5 e 6), moltiplicato per il fattore di diluizione. Cioè, C = (N/n) x (1/20) x fattore di diluizione.

Linee guide per la sicurezza in laboratorio

I fluidi umani come lo sperma e il sangue devono essere considerati potenzialmente infettivi e dovrebbe pertanto essere maneggiati e smaltiti con particolare cura. Precauzioni rigorose vanno prese per evitare ferite accidentali da strumenti affilati contaminati con lo sperma e il contatto dello sperma con pelle aperta, tagli, abrasioni o lesioni. L’infezione può anche verificarsi a seguito di fuoriuscita o schizzi di campioni di sperma infetti. È necessario adottare misure per prevenire e contenere le fuoriuscite.

Usa sempre i guanti e adotta le precauzioni indicate nel testo.

Tutti gli articoli usa e getta (guanti, contenitori di sperma, diapositive) devono essere raccolti per lo smaltimento in un contenitore appropriato. Usate guanti di gomma o di plastica usa e getta quando maneggiate lo sperma o il plasma seminale e tutti i contenitori che sono entrati in contatto con lo sperma o il plasma seminale. I guanti deve essere rimossi quando si esce dall’aula o quando si maneggia il telefono e le maniglie delle porte. I guanti non devono essere riutilizzati.

Occorre lavarsi le mani regolarmente con sapone disinfettante o detergente antisettico per la pelle, soprattutto dopo aver maneggiato i campioni e dopo aver rimosso gli abiti ed i guanti. Se l’esterno di un vaso di raccolta dello sperma è contaminato, deve essere lavato con una soluzione disinfettante. Le superfici di lavoro di laboratorio devono essere decontaminato con un disinfettante immediatamente dopo che si verificano eventuali sversamenti e anche al completamento dell’esperienza.